멤브레인 기술과 백신 규명 (Ⅰ)
백신은 조직 추출물, 박테리아 세포, 바이러스 입자, 포유류 재조합 세포에서 생성된 단백질과 핵산, 효모와 곤충 세포를 포함한 다양한 출처에서 나옵니다.
가장 일반적인 백신 생산 방법은 초기 발효 공정에 이어 정제를 기반으로 합니다. 백신 생산은 여러 단계와 공정을 포함하는 복잡한 공정입니다. 올바른 정제 방법을 선택하는 것은 원하는 최종 제품 순도를 달성하는 데 중요합니다. 백신 정화는 제품 회수와 이후의 하류 정화에 상당한 영향을 미치는 중요한 단계입니다. 백신을 정화하는 데 여러 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 수집 방법과 장비의 선택은 배터리 유형, 수집되는 제품의 특성 및 공정 액체에 따라 달라집니다. 이러한 기술에는 멤브레인 여과(미세 여과, 접선 흐름 여과), 원심 분리 및 심층 여과(정상 흐름 여과)가 포함됩니다. 오랜 경험에 따르면 백신 수확 정화는 일반적으로 원심 분리 후 심층 여과를 통해 달성됩니다.
최근 몇 년 동안, 멤브레인 기반 기술은 백신 정제에서 두드러지게 나타났습니다. 상류 공정은 일회용 기술을 점점 더 많이 사용하고 있으므로 수확 전략은 바뀌어야 합니다. 이 기사에서는 다양한 멤브레인 기반 기술과 백신 정제에서의 응용 분야에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다.
01 소개
백신은 감염병 예방의 중요한 구성 요소이며, 감염병은 여전히 충격적인 사망 원인입니다. 매년 200만~300만 명이 예방 접종 덕분에 디프테리아, 파상풍, 백일해, 홍역으로부터 구해집니다. 백신은 작은 재조합 단백질에서 전체 바이러스 입자, 전체 박테리아에 이르기까지 광범위한 범위를 포괄합니다. 계란, 포유류 세포, 박테리아 등 다양한 시스템에서 생산할 수 있습니다. 백신의 복잡성과 다양성으로 인해 백신 플랫폼에 대한 관심이 증가하고 있음에도 불구하고 현재 주류 정제 프로토콜이나 템플릿은 없습니다.
일반적으로 백신 공정은 상류(생산 및 정화), 하류 처리(초여과, 크로마토그래피, 화학 처리를 포함한 정제), 제형(최종 충전 작업)의 세 부분으로 나눌 수 있습니다. 생산 시스템과는 별개로 정화(원치 않는 물질의 초기 제거)는 견고한 정제 공정을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 적절한 정화 단계는 주로 전체 세포, 세포 파편, 콜로이드 및 큰 응집물을 제거하여 하류 처리의 부담을 줄입니다. 어떤 경우에는 정화가 불용성 불순물, 숙주 세포 단백질(HCP) 및 숙주 세포 핵산을 줄일 수도 있습니다. 다른 정제 단계와 마찬가지로 정화 단계는 백신의 특이성 및 생산 제약에 적응하면서 최대 제품 수율과 순도를 달성하기 위해 최적화되어야 합니다.
백신 유형의 이질성으로 인해 원심분리나 여과를 포함한 다양한 기술이 정제에 사용됩니다(표 1).
일반적으로 원하는 정화를 달성하려면 여러 시리즈의 작업이 필요합니다. 첫 번째 작업은 더 큰 입자를 제거하도록 설계되고(1차 정화) 두 번째 작업은 콜로이드 및 기타 미크론 미만의 입자를 제거하도록 설계되었습니다(2차 정화). 저속 원심분리는 일회성 정화 옵션으로 사용되어 침전을 통해 세포와 세포 파편을 제거할 수 있습니다. 원심분리는 높은 고형물 부하를 처리할 수 있으며 배치 또는 연속 모드와 디스크 원심분리기에서 널리 사용되었습니다. 높은 자본 투자와 유지 관리 비용이 필요하며 신뢰할 수 있는 축소 모델이 부족하여 확장하는 데 어려움이 있습니다. 그러나 일부 상업용 백신 제조업체는 대량 처리량과 더 많은 생산 활동을 포함하는 대규모 생산에서 원심분리기를 사용합니다.
정화 여과는 정상 흐름 여과(NFF, 데드엔드 여과라고도 함) 또는 접선 흐름 여과(TFF, 교차 흐름 여과라고도 함)로 수행할 수 있습니다. 또한 세포 파편, 콜로이드 및 음전하 원치 않는 성분의 유지를 강화하는 양전하 물질과 필터 AID를 포함하는 특정 필터 모드(심층 필터)도 있습니다.
멤브레인 필터는 크기 배제를 통해 입자를 유지하고 높은 먼지 보유 용량이 없으므로 2차 정화 단계에 적합합니다. 심층 필터와 멤브레인 필터는 모두 확장 및 구현이 쉽습니다(간단한 시스템 설계). NFF와 달리 TFF는 주로 1차 정화(미세여과)에 사용됩니다. 차단 범위가 0.1-0.65μm인 멤브레인(바람직하게는 개방형 채널)은 세포, 세포 파편 및 기타 대형 오염 물질을 유지하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 대부분의 TFF 장비는 선형적으로 확장 가능하고 세척 후 재사용할 수 있으므로 단계의 소모품 비용이 크게 줄어듭니다.
정화 단계는 상류와 하류 공정 사이에 있으며, 크로마토그래피나 밀도 구배 원심분리 등의 다른 정제 단계에 시간과 리소스가 우선시되기 때문에 백신 공정 개발 과정에서 간과되는 경우가 있습니다.
백신 제조 공정에 대한 특허조차도 종종 정화 단계를 생략합니다. 정화 효율성은 하류 공정의 성능에 직접적인 영향을 미칩니다. 최적화가 부족한 정화 단계는 살균 필터의 용량에 부정적인 영향을 미치거나 크로마토그래피 수지의 수명을 단축시킬 수 있습니다. 오늘날, 규제 기대치가 더 엄격해지면서 백신 제조업체는 더 순수하고 특성이 잘 밝혀졌지만 저렴한 백신을 생산하게 됩니다. 이 경우 모든 단계에 마땅한 주의를 기울여야 합니다. 현재 추세에 따르면 상류 공정은 생산성이 증가하고 세포 밀도가 더 높은 "더 깨끗한" 발현 시스템(즉, 혈청이 없는 배지에서 배양된 세포가 계란을 대체)으로 이동하고 있습니다.
하류 정제 공정은 최종 제품의 순도를 높이기 위해 간소화되고 간소화되고 있습니다. 이러한 변화를 처리하기 위해 정화 단계가 병목 현상이 되어서는 안 됩니다. 이 경우 여과 기술은 새로운 정화 과제를 충족하여 프로세스 유연성 증가, 단일 사용 가능성 및 투자 비용 절감 문제를 해결합니다.
02 바이러스 백신의 명확화
여러 가지 정화 방법을 단독으로 또는 조합하여 사용하여 백신의 사료 단계에서 수확물을 정화하는 데 성공적으로 활용되었습니다.
시험 규모 : 1-20L, 생산 규모 : 20L 이상
2.1 바이러스 백신 접종 시 주의사항
많은 백신에는 바이러스 감염에 대한 면역을 형성하기 위해 바이러스 입자의 일부 또는 전부가 들어 있습니다. 일반적으로 네 가지 광범위한 범주로 나뉩니다.
약독화 생백신(LAV)은 바이러스의 독성을 줄이기 위해 약화된 균주를 기반으로 합니다. 약독화된 바이러스는 체내에서 복제될 수 있지만 병원성은 없습니다.
- 불활성화 바이러스(IV) 백신은 감염성을 제거하기 위해 화학적 또는 자외선으로 불활성화된 바이러스를 함유합니다. 바이러스 입자는 완전하거나, 분할되거나, 정제될 수 있습니다(항원 단백질만).
- 바이러스 벡터(VV) 백신은 병원성 바이러스의 항원을 제시하는 활성 비병원성 바이러스입니다. 이러한 최근 개발된 구조는 유전자 치료 응용 분야에도 사용됩니다.
바이러스 유사 입자(VLP) 백신은 바이러스 입자의 전체 구조를 모방하지만 감염성 유전 물질을 포함하지 않는 특정 종류의 바이러스 아단위 백신입니다.
대부분의 경우, 바이러스 입자는 정화 단계, 심지어 바이러스 백신의 용해 과정에서도 완전히 손상되지 않습니다(분해는 일반적으로 더 정제된 환경에서 하류에서 수행됩니다).
바이러스 정화의 주요 과제는 세포 파편, 큰 응집물 및 불용성 오염 물질을 효율적으로 제거하는 동시에 고수율 바이러스 입자를 회수하는 것입니다. 다음 섹션에서 설명했듯이 바이러스 분해 또는 손실을 일으킬 수 있는 요인이 여러 가지 있습니다. 또한, 특히 LAV 및 VV 백신의 경우 프로세스의 이 단계에서 바이러스 정량 분석 방법의 높은 가변성으로 인해 바이러스 수율을 의지하기 어려울 수 있습니다. 이러한 백신의 경우 바이러스 수율은 종종 플라크 테스트 또는 TCID 50 테스트와 같은 감염성 테스트를 사용하여 평가됩니다. 수확된 화합물 중 일부가 바이러스가 지시 세포를 감염시키는 능력을 방해할 수 있다는 사실은 이러한 정량적 접근 방식의 가변성을 증가시킵니다.
2.2 바이러스 백신 명확화 전략
바이러스 백신은 크기, 구조, 모양, 발현 체계가 매우 다양합니다(표 3).
결과적으로, 일반적으로 하류 프로세스, 특히 정화 단계에 대한 템플릿이 없습니다. 이론적으로, 모든 사용 가능한 기술(저속 원심분리, 미세여과 TFF, NFF)을 선택하여 잠재적으로 결합하여 바이러스를 정화할 수 있습니다. 사실, 정화 방법의 성공은 발현 시스템과 관련 바이러스의 물리화학적 특성에 영향을 받습니다.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} cells /ml) 정화 방법은 양이온성 폴리머를 사용하여 기존 방법에 비해 심층 여과 면적을 4배 줄였습니다. 이 기술을 사용하면 원심분리기를 사용하지 않고도 대용량 발효조를 수확할 수 있습니다. 마찬가지로 Riske et al.은 1.4-2.6% 고형물을 함유한 40L 세포 배양액(0.02%)을 키토산으로 처리하면 심층 여과 후 절대 여과 용량이 7-배 증가한다는 것을 보여주었습니다.
또한 키토산은 일반적으로 원심분리기에서 침전되는 미크론 이하의 입자를 응집시켜 정화 효율을 개선하는 것으로 보인다고 언급합니다. 전처리 및 응집 방법은 앞으로도 백신 여과 정화의 일부가 될 가능성이 높습니다. 당, 글리콜, 아미노산을 포함한 침투제는 바이러스를 우선적으로 응집시킵니다. 삼투압 용액을 사용한 바이러스 응집 후 0.2µ 미세여과를 바이러스 정제를 위한 포괄적인 공정으로 사용할 수 있습니다. 침투제는 입자 주변의 수화층을 줄여 소수성 비캡슐화 바이러스 입자와 캡슐화된 바이러스 입자를 응집시켜 바이러스 응집을 자극할 수 있습니다. 침투제가 바이러스를 응집시키는 것으로 나타났지만, 이 방법은 앞으로 백신 정제를 위한 플랫폼이 될 가능성이 있으며, 파일럿 또는 대규모 백신 정제에서의 타당성은 입증되지 않았습니다. 앞으로도 백신 필터 정화의 일부가 될 가능성이 높은 응집 전처리 방법은 2L 발효조에서 수행됩니다. 이러한 방법을 대규모 생산 작업에 사용하려면 시험 및 생산 규모에서 검증이 필요합니다.
2.2.1 시스템 영향 표현
정화 방법은 주로 상류 공정 및 발현 시스템의 유형에 따라 달라지며, 이는 제거해야 할 오염 물질의 유형과 수준을 결정합니다. 바이러스 백신은 일반적으로 포유류나 조류의 연속 세포주 또는 바큘로바이러스/곤충 세포에 의해 닭 배아에서 생산되며, 이는 보다 복잡한 발현 시스템입니다. 일부 유형의 VLP는 다른 이종 발현 시스템(박테리아, 효모, 식물 세포)에 의해 생산될 수도 있습니다.
2.2.1.1 닭 배아에서 생성된 바이러스
백신은 수십 년 동안 계란에서 생산되었습니다. 이 연구는 우드러프와 굿 파스처가 수정란의 융모막-요막 막을 바이러스 증식 기질로 성공적으로 사용한 1931년으로 거슬러 올라갑니다. 오늘날에도 여전히 많은 인간 및 수의학 백신이 이 고대 공정을 사용하여 생산되고 있습니다. 가장 잘 알려진 것은 아마도 계절성 독감 백신일 것입니다. 원리는 관심 있는 바이러스로 닭 계란을 접종한 다음 융모막-요막에서 복제하는 것입니다. 번식 후 바이러스 입자가 풍부한 요막액을 수집하여 정제합니다.
알란토산액은 까다로운 정화 사료입니다. 높은 미네랄과 단백질 함량(오발부민 포함)으로 인해 점도가 높습니다. 알란토산액에는 깃털, 부리, 혈관 또는 혈액 세포와 같은 닭 배아의 필수 조직 화합물도 포함되어 있습니다. 고형물 함량이 높기 때문에 저속 원심분리가 1차 정화에 선호되는 옵션으로, 일반적으로 약 70%의 회수율을 보입니다. 그러나 여과 기술을 사용한 1차 정화도 가능합니다. NFF의 경우 폴리프로필렌 및 셀룰로스 기반 심층 필터는 알란토산액 수집 기능이 우수합니다. 폴리프로필렌 또는 셀룰로스 기반 심층 필터로 만든 표면 필터는 용량이 150-210L/m²이고 공급 흐름 탁도를 최대 3배까지 줄일 수 있습니다. 개방형 공급 채널 TFF 장치는 알란토산액 정화에도 적합합니다. 이 장치는 공급 채널을 통한 압력 손실을 최소화하는 데 더 적합하여 채널 막힘을 줄일 수 있습니다.
2차 정화 단계는 NFF로 쉽게 수행할 수 있습니다. 폴리프로필렌, 셀룰로스 및 유리 섬유 재료의 조합은 일반적으로 좋은 효율을 보이고 2차 정화 단계에 대한 대안은 TFF와 {{0}}.65μm 또는 0.45μm 미세여과 멤브레인 장치를 사용하고 삼투 유량 제어를 작동하는 것입니다. 이 단계에서는 친수성 PVDF 또는 친수성 PES 멤브레인이 있는 개방형 채널 TFF 장치를 사용할 수 있습니다.
바이러스 입자는 불용성 파편 물질과 연관될 수 있으며, 이는 정화 중에 바이러스 생산을 상당히 감소시킬 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 소금 용액을 사용하면 인플루엔자 바이러스와 고체 조각 간의 이러한 연관을 줄일 수 있으며, 바이러스 입자의 무결성에 영향을 미치지 않고도 생산을 약 2배 증가시킬 수 있습니다.
2.2.1.2 포유류와 조류 세포주에서 연속적으로 생성되는 바이러스
최근 일부 바이러스 백신은 계란 기반 공정에서 세포 배양 기반 공정(특히 인플루엔자 백신)으로 전환되었습니다. 이러한 전환의 주된 이유는 배아란과 관련된 백신 생산 문제(즉, 가금류 질병이 발생할 경우 발생할 수 있는 계란 공급 부족)를 방지하기 위한 것입니다. 그 결과 현재 많은 유형의 백신과 바이러스 벡터가 포유류나 조류의 연속 세포주, 기존 세포주(예: Vero, MDCK 또는 HEK293 세포주) 또는 독점 세포주를 사용하여 개발되고 있습니다.
발현 시스템에 따라 바이러스는 세포 내부에 머물러 세포 용해 단계가 필요하거나 세포 외부에 머물러 있을 수 있습니다(용해 또는 출아). 세포 배양에서 얻은 고체 부하 및 가용성 함량은 알란토산 액상보다 훨씬 깨끗합니다. 결과적으로 NFF 기술은 구현하기 쉽고 용량이 상당히 높습니다. 그러나 여과 용량은 세포 밀도 또는 수확 시 세포 생존력과 같은 세포 배양 조건에 크게 좌우됩니다. 이러한 매개변수는 깊은 필터와 막을 막을 수 있는 세포 파편과 거대 응집체의 양에 영향을 미쳐 용량이 감소합니다.
Thomassen 등은 NFF 정화의 좋은 예를 제공합니다. 불활성화된 폴리오바이러스(IPV) 생산 공정에 사용됩니다. 미세담체에서 배양된 Vero 세포는 세포 밀도 {{0}}.78 x 106 cells /ml TOI로 바이러스 증식에 사용되었습니다. 75μm 스테인리스 스틸 스크린은 수확물에서 미세담체를 제거하기 위한 사전 정화에 사용됩니다. 이중층 등급은 밀도 심층 필터(0.2-2.0μm)를 사용하여 정화한 다음 멸균 등급 필터를 사용합니다.
선택된 확장 가능한 일회용 유닛은 350L 규모에서 Sabin IPV 임상 시험 재료의 준비에 성공적으로 사용되었습니다. 바이러스 혈청형에 따라 86에서 96%의 바이러스 회수율을 얻습니다.
2.2.1.3 곤충세포계에서 생성되는 바큘로바이러스/바이러스 유사 입자
대규모 백신 생산을 위한 바큘로바이러스/곤충 세포 시스템에 대한 고려는 비교적 새로운 것이지만, 바이러스 벡터와 VLP 분야에서 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다. 이 시스템의 주요 이점은 수명이 짧고(세포주를 확립할 필요 없음) 안전(완전한 바이러스 DNA 없음)한 생산이 가능하다는 것입니다. 바큘로바이러스 제거 및 제품 안정성이 필요하다는 등 몇 가지 단점도 있습니다.
GlaxoSmithKline에서 생산한 인간 유두종 바이러스 감염에 대한 VLP 백신인 Cervarix는 곤충 세포에서 상업적으로 생산된 최초의 인간 백신입니다. 바큘로바이러스에 감염된 곤충 세포에서 생산된 VLP와 rAAV 벡터를 기반으로 하는 여러 백신이 현재 개발 중입니다. 가을 군벌레 Spodoptera frugiperda(Sf9 및 Sf21)와 양배추 구더기 Trichoplusia ni(BTI-TN5B1-4 세포)에서 유래한 곤충 세포주는 현탁액에서 자랄 수 있는 능력으로 인해 가장 일반적으로 사용되며, 이는 상류 공정의 증폭을 간소화합니다. 원하는 밀도의 살아있는 세포로 자른 후, 이러한 세포는 단백질 발현을 위해 지수 세포 성장 단계에서 재조합 바큘로바이러스로 감염됩니다. 바큘로바이러스의 큰 게놈은 5개 이상의 다른 단백질을 발현할 수 있게 하며, 이는 VLP와 바이러스 벡터의 복잡성과 일치합니다.
Bernard 등은 곤충 세포 배양의 하류 공정을 설명했습니다. 이 공정은 매우 가변적이며, 이 기술로 생산된 단백질의 다양성을 반영합니다. 정제 순서의 첫 번째 단계는 생물 반응기의 부피 특성(즉, 세포 밀도 및 생존력) 또는 제품 방출의 특성(싹트기 또는 세포 용해에 의해 분비됨)에 크게 영향을 받습니다. 곤충 세포의 바큘로바이러스 감염은 3-5일 이내에 세포 용해를 일으킬 수 있습니다. 세포 파괴는 단백질 분해 활성 및 재조합 단백질의 분해로 이어질 수 있는 기타 환경 요인의 증가로 이어질 수 있습니다.
세포 용해를 시작하는 능력이 낮은 바쿨로바이러스를 개발하려는 시도가 있었습니다. 바쿨로바이러스는 감염된 곤충의 10% 미만을 용해합니다.
세포 용해는 동결-해동, 세제, 균질화기 또는 초음파 처리와 같은 다양한 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다.곤충 세포에는 세포벽이 없으므로 빠르게 용해됩니다.초음파 처리가 많은 벤치 프로세스에서 보고되었지만 실험적 또는 상업적 규모에서는 거의 사용되지 않습니다.가장 일반적인 방법은 저농도 세제(0.1% Triton X-100 또는 NP-40)가 있는 상태에서 균질화기를 사용하여 세포를 파괴하는 것입니다.세제와 미세유동화 또는 삼투 충격 균질화의 사용은 많은 대규모 제조 프로세스에서 성공적으로 사용되었습니다.일반적으로 곤충 세포는 용해 완충액(50mM TRIS pH7.7, 300mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.2mM PMSF 및 프로테아제 억제제)에 현탁한 후 최종 농도가 0.1%가 되도록 Triton-X100을 첨가한 다음 가벼운 초음파 또는 미세유동화를 수행합니다. 그런 다음 혼합물을 원심분리하여 불용성 입자를 제거합니다.
이 단계에서 용해물은 매우 흐릿하게 보일 수 있으며 0.45μm 필터를 사용하여 여과하기 어렵습니다. 때로는 열분해 정화 단계에서 최대 30%의 손실이 관찰될 수 있습니다. 분열 단계에서 벤조효소를 첨가하면 여과 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다. 수확 후 인산 완충 염수로 세포를 세척하고 균열 완충액이 포함된 고염(500mM NaCl)에서 빠르게 "동결-해동"하면 응집물을 제거하는 데 도움이 됩니다.
곤충 세포에서 생성된 VLP와 바이러스 벡터의 정화는 세포 용해(화학적 또는 기계적 처리) 후에 발생하며, 이때 바이러스 입자뿐만 아니라 대량의 세포 핵산도 방출됩니다. 곤충 세포는 1-9.10 6 cells/ml의 높은 세포 밀도로 성장할 수 있습니다. 따라서 정화 단계는 높은 세포 밀도, 높은 핵산 함량 및 가능하면 바큘로바이러스 입자 제거를 다루어야 합니다. 문제를 더 복잡하게 만들기 위해 VLP 또는 바이러스 벡터와 바큘로바이러스는 크기가 비슷할 수 있습니다(바큘로바이러스는 너비가 60-80나노미터이고 길이가 300-400나노미터입니다). 높은 세포 밀도로 인해 원심분리는 수십 년 동안 1차 정화를 위한 선호되는 기술이었습니다. 그러나 확장성을 정의하기 쉽기 때문에 멤브레인 공정이 매우 매력적인 대안으로 보입니다.
심층 필터는 3층 로타바이러스 유사 입자의 하류 공정에서 효과적으로 사용되었습니다. 실험실 수준에서 CsCl 밀도 구배 초원심분리법은 종종 이러한 복잡한 입자를 정제하는 데 사용됩니다. 연구자들은 심층 필터의 정화 단계뿐만 아니라 전체 하류 공정(트리톤 X-100 절단 및 심층 여과, 그 다음 초여과 및 입자 크기 배제)도 평가했습니다. 결과에 따르면 CsCl 밀도 구배 수율은 37%에 도달할 수 있습니다.
초원심분리법은 약 10%입니다. 또 다른 예로, 0.45μm 중공 섬유와 500kDa 미세 직경 섬유를 사용하여 곤충 세포에서 생성된 HIV 유사 입자를 회수하고 농축했습니다. 이 연구에서 중공 섬유의 전단력은 세포 무결성을 기반으로 최적화되었습니다. 결과 낮은 전단력 공정이 테이블 설탕 기울기 초원심분리를 대체하기 위해 확립되었습니다.
이 공정은 대량 생산에 적용될 수 있는 잠재력이 있습니다. 깊은 필터는 또한 재조합 아데노 연관 바이러스의 생산에 성공적으로 사용되었습니다. 세포 용해는 2피스톤 기계적 세포 재머로 수행한 다음 뉴클레아제 처리를 수행했습니다. 정화 단계에서 1.2μm 유리 섬유 깊은 필터 요소를 사용한 다음 두 겹의 0.8μm 친수성 PES와 0.2μm 친수성 PES를 사용했습니다. 비례적으로 크기가 조정된 필터는 더 작은 크기에서 200 L 크기까지의 공정 배치에 사용됩니다. 깊은 필터는 성공적으로 사용되었으며 0.2µm 또는 0.45µm의 평평한 필름 또는 중공 섬유를 사용한 TFF 등급도 매우 효과적인 것으로 보고되었습니다.
포르투갈의 Oeiras Institute of Experimental Biology에 있는 Tecnologica(IBET)의 연구에서는 원심분리 없이 바큘로바이러스가 발현한 C형 간염 VLP를 정화하기 위해 NFF를 사용했습니다. 정격 폴리프로필렌 필터(10,5,0.6 및 0.3μm) 필터는 VLP 수확을 정화하는 데 사용됩니다. 0.6μm 및 0.3μm 기공 정격을 가진 동일한 필터는 VLP 수확 센터에서 여과에 사용됩니다. 연구된 모든 여과액은 HCV-VLP 회수율에 대해 테스트되었고 권장 여과 방법이 비교되었습니다. 결과는 표 4에 나와 있습니다.
결과는 5μm-0.3μm 필터가 직접 수확한 C형 간염 VLP 사료에 대해 가장 높은 제품 회수율(100%)을 보였다는 것을 보여주었습니다. 폴리프로필렌 0.6μm 필터는 중앙 사료에 대해 가장 높은 제품 회수율(82%)을 보였고, 숙주 세포의 DNA 클리어런스는 약 70%였습니다.
2.2.1.4 박테리아 또는 효모 시스템에서 생성되는 바이러스 유사 입자
박테리아 또는 효모 시스템에서 발현되는 VLP 백신에 대한 정화 방법의 유형은 세포외 매개체로의 VLP 방출에 따라 달라집니다. VLP를 효율적으로 분비할 수 없는 경우 실제 정화 단계 전에 세포 용해 또는 기타 추출 단계가 필요할 수 있습니다. 이것이 단백질 정화 산업의 황금 표준이지만, 박테리아 또는 효모 기반 시스템에서 발현되는 원심분리(연속 또는 배치)는 최근 확장성과 일회용 처리와의 호환성이 용이하기 때문에 막 공정이 매우 매력적인 대안이 되었습니다.
Richter와 Topell은 정화된 E. coli에서 생산된 VLP를 준비할 때 원심분리, TFF 또는 두 가지의 조합을 사용하는 것을 설명합니다. 그들의 연구에서, 0.45m TFF 멤브레인은 5도의 온도에서 균질화된 E. coli 균질물을 희석하고 정화하는 데 사용되었습니다. 그들은 또한 멤브레인 기반 TFF가 고점도 수확물을 처리하는 데 적합하며, 바람직하게는 개방형 채널 구성의 TFF 장치를 사용하는 데 적합하다고 언급합니다.
원심분리 정화는 또한 TFF의 대안으로 평가되었습니다. 이 경우 생성된 균질물은 희석되지 않고 4도에서 105분, 10000g 동안 원심분리되었습니다. 부드러운 코팅을 옮기지 않고 상층액을 입자에서 붓고 4도 및 10,000g에서 60분 동안 재원심분리했습니다. 그런 다음 상층액을 현재 입자에서 제거하고 EB 완충액(43.89mM Tris HCl, 6.11mM Tris Base, 5.0mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2로 희석하고 0.22m 멸균 필터 장치에서 여과했습니다. 추가 처리. 또한, 800L 규모로 대장균에서 이 VLP 백신을 생산하는 스케일업 공정은 원심분리와 TFF를 조합하여 명확해졌다고 보고되었습니다.
재조합형 E형 간염 백신 HEV 239는 중국에서 16세 이상 성인의 면역 접종을 위해 허가되었습니다. 백신 항원(VLP)은 E. coli에서 발현되며 항원 생산 공정의 스케일업은 50L 규모인 것으로 입증되었습니다. E. coli를 분해하여 제품을 추출하고, 2% Triton X-100가 포함된 완충액으로 강력히 세척하여 세포 조각에서 포함체를 분리한 다음 4 M 우레아 균질화기로 용해했습니다. TFF는 Saccharomyces cerevisiae(15L)에서 생산된 인간 유두종 바이러스 VLP를 정화합니다. 뉴클레아제로 처리한 세포 용해물은 0.65 μm 중공 섬유 필터를 사용하여 투과 여과 모드에서 교차 흐름 미세 여과로 정화했습니다. 백신 생산에는 동일한 공정이 사용됩니다. 상업적 규모에 도달한 VLP 기반 백신은 극소수에 불과하지만, 여러 VLP 기반 백신이 개발 중에 있으며, 대부분은 원심분리나 막 기술을 사용하여 정제됩니다.
공간의 영향으로 인해 다음 장에서 내용의 후반부를 공유하겠습니다. 다음 기사에서는 백신 정화 및 관련 멤브레인 구성 요소의 사용 사례 몇 가지를 공유하겠습니다.
현지화 회로의 첫 번째 회사로서, Guidling Technology는 백신 정화에 대한 충분한 관련 경험을 축적했습니다. Guidling Technology는 생물약학 및 세포 배양, 정제 및 분리에 중점을 둔 개발 및 생산 회사입니다. 제품은 생물의학, 진단, 산업용 유체 여과, 검출, 정화, 정제 및 농축 공정에 널리 사용됩니다. Guidling은 초여과 원심분리관, 초여과/미세여과 멤브레인 카세트, 바이러스 제거 필터, 접선 흐름 필터 장치, 심층 멤브레인 스택 등을 성공적으로 개발하여 생물약학 및 세포 배양의 적용 시나리오를 완벽하게 충족합니다.
당사의 멤브레인과 멤브레인 필터는 사전 여과, 미세 여과, 초여과 및 나노 여과의 농축, 추출 및 분리에 널리 사용됩니다. 소규모 일회용 실험실 여과부터 생산형 여과 시스템, 무균 테스트, 발효, 세포 배양 등에 이르기까지 광범위한 제품군은 테스트 및 생산의 요구를 충족할 수 있습니다.