mRNA 약물 제조 공정에 대한 전체 분석: TFF 기술이 정제 문제를 해결하는 방법
최근 몇 년 동안 mRNA 기술은 바이오의약품 분야에서 획기적인 진전을 이루었으며, 특히 백신과 유전자 치료 분야에서 엄청난 응용 가능성을 입증했습니다. mRNA 백신의 성공적인 개발은 감염성 질병의 예방과 통제를 위한 새로운 솔루션을 제공했을 뿐만 아니라 암 면역요법과 맞춤 의학의 발전을 주도했습니다. 새로운 종류의 치료 제품인 대규모-mRNA 제조는 RNA 안정성 제어, 잔류 효소 및 반응 부산물 제거,-버퍼 교환, 높은 순도 회수율 달성 등을 포함하여 매우 까다롭습니다. 이 모든 작업에는 규제-승인 솔루션을 갖춘 제조 기술이 필요합니다.
mRNA 백신 또는 치료제의 제조 공정은 주로 플라스미드 DNA 벌크 용액 준비, mRNA 벌크 용액 준비, mRNA-LNP 의약품 준비의 세 단계로 나뉩니다.
mRNA 약물 제조 공정 흐름도
잘 정립된 막 분리 기술인 TFF(접선유동여과)(TFF)는-고효율 분자 체 분리 기능, 제어 가능한 완충액 교환 및 낮은 전단 응력 특성으로 인해 mRNA 제조에 널리 적용됩니다. 멤브레인 모듈 설계를 기반으로 하는 일반적인 TFF 구성에는 평판-시트 카세트와 중공{4}}섬유 모듈이 포함됩니다. 또한, TFF의 압력- 구동 막 분리는 막 공극 크기에 따라 미세여과(MF), 한외여과(UF), 나노여과(NF) 및 역삼투(RO)로 분류될 수 있으며 선택성이 점차 증가합니다.
TFF는 플라스미드 DNA 벌크 준비, mRNA 벌크 생산 및 mRNA-LNP 의약품의 최종 제형을 포함하여 mRNA 의약품 제조의 여러 단계에서 중요한 역할을 합니다. TFF는 멤브레인 유형, 분자량 차단(MWCO) 및 멤브레인 재료의 적절한 선택을 통해 반응 부산물-과 저-분자량-불순물을 효율적으로 제거하는 동시에 LNP 캡슐화 전후에 완충액 교환 및 농축을 촉진합니다. 이는 RNA 순도, 안정성 및 전반적인 공정 확장성을 크게 향상시킵니다.
또한 접선 유동 여과의 성능은 펌프 유형 및 튜브 설계와 같은 시스템 구성 요소뿐만 아니라 막횡단 압력(TMP), 전단 응력 및 여과 유량을 포함한 주요 공정 매개변수의 영향을 받습니다. 이러한 요소는 대상 제품의 특성을 기반으로 신중하게 선택하고 최적화해야 하며, 특히 처리 중 외부 기계적 힘에 매우 민감한 mRNA-LNP와 같은 스트레스-민감한 제품의 경우 더욱 그렇습니다.
플라스미드 DNA 정제
플라스미드 DNA 저장 용액의 준비는 기본적으로 전사 템플릿의 서열 설계를 기반으로 합니다. 준비 방법에는 일반적으로 플라스미드 DNA 증폭이 포함되지만 PCR 증폭도 사용할 수 있습니다. DNA 증폭을 예로 들어 공학적으로대장균일반적으로 발효-기반 증폭에 사용됩니다. 다운스트림 정제 공정에는 주로 세포 수집, 용해 및 정화, 농축 및 완충액 교환, 멸균 여과, 선형화 및 크로마토그래피 정제가 포함됩니다. 산업 환경에서는 연속-흐름 원심분리가 세포 수집에 자주 사용되지만 상대적으로 높은 전단력이 발생합니다. 개방형 채널과 낮은 전단력을 갖춘 중공 섬유 시스템은 플라스미드 DNA와 같이 고형분 함량, 점도가 높거나 전단 감도가 높은 시료를 처리하는 데 더 적합합니다. 수집 후 세포는 고압 균질화, 초음파 처리 또는 알칼리 용해를 거친 후 심층 여과를 통해 예비 정화됩니다.
후속 크로마토그래피를 용이하게 하기 위해, 분자량 차단이 30kDa, 100kDa 또는 300kDa인 막 카세트 또는 중공 섬유 컬럼을 사용하는 접선유동여과(TFF)가 농축 및 완충액 교환을 위해 먼저 사용되는 경우가 많습니다. 이는 RNA, 숙주 세포 단백질(HCP) 및 숙주 세포 DNA 단편(HCD)과 같은 일부 불순물을 동시에 제거하는 동시에 샘플 양을 줄입니다. 크로마토그래피는 핵심 정제 단계 역할을 합니다. 일반적으로 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)와 결합되어 불순물을 효율적으로 제거하고 생체활성이 높은 슈퍼코일 플라스미드 DNA를 풍부하게 하여 플라스미드 순도를 크게 향상시킵니다.
정제 후, 플라스미드를 다시 TFF에 적용하여 용액을 목표 농도(보통 0.5-2 mg/mL)로 농축하고 최종 저장 완충액으로 투석을 수행합니다. 이 단계에서는 공정에서 잔류 염과 유기 용매를 제거하여 완충 시스템이 다운스트림 체외 전사(IVT) 반응에 대한 요구 사항을 충족하는지 확인합니다.
시험관 내 전사(IVT) mRNA의 정제
시험관 내 전사(IVT) 및 변형은 mRNA 스톡 솔루션 준비의 핵심 프로세스입니다. IVT mRNA 생산 중에는 접선유동여과(TFF1) - 크로마토그래피 - 접선유동여과(TFF2)의 조합이 사용됩니다. 이 전략은 효율적이고 고품질{4}}mRNA 정제를 보장하여 백신 제조에 중요한 지원을 제공합니다.
전사 및 변형 반응이 완료된 후, 일반적으로 분자량 컷오프가 30kDa, 100kDa 또는 300kDa인 막 카세트 또는 중공 섬유 컬럼을 사용한 한외여과/정용여과가 먼저 수행됩니다. 이 단계는 RNA 중합효소, 잔여 DNA 단편, 미반응 NTP, 캡핑 효소, 이중{6}}dsRNA(이중 가닥 RNA), 소-분자 억제제 등 반응 시스템에서 다양한 공정 관련 불순물을 효과적으로 제거하는 동시에 완충액 교환을 달성합니다. 단일 접선유동여과 단계 후에는 대부분의 불순물이 효과적으로 제거되며 검출 가능한 유일한 잔류 단백질 불순물은 RNA 폴리머라제입니다.
이어서, 추가 정제를 위해 다중 크로마토그래피 기술이 적용됩니다. 일반적으로 사용되는 방법에는 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 이온-쌍 역-상 크로마토그래피 및 이온-교환 크로마토그래피가 포함됩니다. 한외여과와 순차 크로마토그래피의 조합을 통해 mRNA는 높은 수준의 순도를 달성합니다.
제제화 또는 보관 요구 사항을 충족하기 위해 mRNA 스톡 용액은 30kDa, 100kDa 또는 300kDa 멤브레인 카세트 또는 중공 섬유 컬럼을 사용하여 다시 농축 또는 희석되어 표적 농도를 정확하게 조정하고 최종 제제 완충액으로 교환됩니다. 마지막으로 멸균-등급 여과를 적용하여 미생물 부하를 제어하고 임시 보관 및 재료 충전을 완료합니다.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25LMH).
mRNA{0}}LNP 제제의 정제
지질 나노입자(LNP)는 현재 mRNA 치료제에 대해 가장 광범위하게 연구된 전달 시스템입니다. 현재 다양한 mRNA-LNP 제형이 전임상 및 임상 개발의 다양한 단계에 있습니다. LNP는 제조 공정에 매우 민감합니다. mRNA-LNP 생산에 필요한 단위 작업 중에서 접선유동여과(TFF)와 멸균 여과를 통한 농축 및 완충액 교환은 상당한 과제를 안겨줍니다. 이러한 단계는 프로세스 확장성과 제품 품질을 보장하는 동시에 멤브레인 오염 및 잘못된 필터 로딩과 같은 문제를 방지하기 위해 신중하게 최적화되어야 합니다.
mRNA 캡슐화 후 접선유동여과(TFF)를 사용하여 정제합니다. 이 단계의 목적은 캡슐화되지 않은 mRNA, 자유 중합체 또는 지질 물질뿐만 아니라 mRNA 및 지질에서 잔류 용매를 제거하는 것입니다. mRNA{2}}LNP는 실온에서 안정성이 제한되어 있으므로 TFF를 포함한 다운스트림 공정의 최적화는 제품 품질을 유지하는 데 중요합니다.
주요 최적화 방향에는 다음이 포함됩니다. 여과 효율성과 입자 스트레스의 균형을 맞추기 위해 mRNA{0}}LNP의 입자 크기와 안정성을 기반으로 막횡단 압력(TMP)과 접선 유속을 적절하게 설정합니다. 입자 흡착 또는 손상을 최소화하면서 유리 mRNA, 불순물 및 교환 완충액을 효율적으로 제거하기 위해 적절한 분자량 컷오프(MWCO, 예: 100kDa 또는 300kDa)를 갖는 멤브레인 또는 중공 섬유 컬럼을 선택합니다. 농도 및 정용여과 용량을 최적화하여 표적 제제로의 효과적인 완충액 교환을 보장하고 최종 입자 농도 및 분산도를 제어합니다.
또한 중요한 품질 속성(예: 입자 크기, 다분산 지수(PDI), mRNA 캡슐화 효율성)은 프로세스 중에 면밀히 모니터링되어야 하며 매개변수는 실시간 데이터를 기반으로 동적으로 조정되어 안정적이고 확장 가능하며 효율적인 mRNA{1}}LNP 정제 및 제제화를 달성해야 합니다.
또한 최종 멸균 방법에서는 mRNA{0}}LNP와 그 구성 요소가 불안정하기 때문에 박테리아 및 기타 미생물 오염 물질을 제거하는 데 일반적으로 0.2μm 멸균{2}}등급 필터가 사용됩니다.
