적절한 한외여과관을 선택하는 방법

단백질 농축 및 완충액 교체에 일반적으로 사용되는 한외여과 튜브는 종종 한외여과 튜브에 사용됩니다. 표적 단백질의 분자량, 농축 전 부피 및 농축 목표 부피에 따라 부피 크기 및 한외여과관이 다른 모델이 있습니다. 재사용 가능.

1. 주로 MWCO 및 농도 부피를 고려하여 적합한 한외여과관을 선택합니다. 일반적으로 분자량은 표적 단백질의 분자량의 1/3 이하여야 한다. 목표 단백질의 분자량이 약 10kd이면 유지 분자량이 3KD인 한외여과관을 사용할 수 있습니다.

2. 새로 구입한 한외여과기는 건식입니다. 사용하기 전에 미리 물을 추가하십시오. 물은 멤브레인을 완전히 통과하고 몇 분 동안 얼음 욕조 또는 냉장고에서 미리 냉각됩니다. 그런 다음 물을 부어 단백질 용액을 추가합니다. 단백용액의 양은 시험관 윗면의 흰색선을 넘지 않아야 한다. 쉬운 조작. 단백질 용액을 추가하기 전에 한외여과 튜브를 미리 냉각하기 위해 얼음에 삽입해야 합니다.

3. 균형. 질량과 무게 중심이 균형을 이루어야 합니다. 속도와 가속도가 너무 빨라서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 한외여과막이 직접 손상됩니다. 원심 한외여과를 시작합니다(원심분리기를 4도로 미리 냉각). 다이어프램과 회전축의 방향은 지침에 따라 조정할 수 있습니다(각도 원심분리기의 경우 다이어프램이 샤프트에 수직). 실제 사용시 일반 속도는 매뉴얼에 명시된 속도보다 낮으므로 원심 파이프의 수명이 연장될 수 있습니다.

4. 남은 1ml로 농축되면 [가정용 브래드포드용액 50ul를 취하여 액체 10ul를 넣어 청색으로 변하는지 확인하고 한외여과관에서 단백질이 누출되는지 확인한다. 튜브가 누출되면 상층에 부은 다음 새 튜브로 다시 흐르게 하여 한외여과를 시작합니다. 시험관 누출 여부를 정확히 판단하기 위해서는 5mg 10min 원심분리기를 10분 통과시킨 후, protein gel 또는 Bradford를 실행 [coarse measurement]합니다. 모든 농축 용액이 추가될 때까지 농축할 나머지 단백질 용액을 계속 추가합니다(단백질 가열을 방지하기 위해 얼음 위에서 작동). 원심분리 중 단백질 침전이 발생하여 튜브 막힘이 발생하는지 주의하십시오. 침전이 발생하면 단백질 농도가 너무 높거나 버퍼가 부적절한지 여부, 침전의 특정 원인을 확인하십시오. 전자는 농도를 줄이기 위해 동시에 여러 한외여과 튜브를 사용하여 해결할 수 있으며, 후자는 단백질이 침전될 때까지 다른 완충액을 변경할 수 있습니다.

5. 이전 단계는 단백질을 농축하는 데 사용됩니다. 완충액을 교체할 경우 총 단백질 용액이 약 1ml로 농축되었을 때 새 완충액을 조심스럽게 첨가(0.22um 한외여과막을 통한 한외여과)한 후 약 1ml로 3회 연속 농축하여 최종 농도는 일반적으로 500ul 이하 또는 200ul 이하인 필요한 단백질 농도에 따라 다릅니다. 매회 최소 10배의 부피 농도에 따라 3배의 1000배 이상으로 기본적으로 버퍼 교환의 목적을 달성할 수 있습니다.

6. 최종 단백질 농축액을 제거합니다. 얼음 위에서 작동합니다. 노란색 피펫 팁(200ul)을 사용하여 가장자리를 따라 피펫 팁을 부드럽게 삽입한 다음 부드럽게 불어서 단백질 용액을 혼합합니다. 한외여과막을 만지지 않도록 주의하십시오. 농축액이 완전히 빨릴 때까지 매번 200ul씩 빨아들인다. 시험관 바닥에 있는 마지막 농축 용액을 추출할 필요는 없으며, 그렇지 않으면 너무 어려워 한외여과막이 손상될 수 있습니다. 마지막으로, 한외여과막을 통과하지 않고 밀리크 물을 한외여과 튜브에 첨가하여 수분 손실 및 막 건조를 방지합니다.

7. 다음은 한외여과관을 처리하고 한외여과관을 재사용하는 단계입니다.

8. 한외여과관에 물을 붓고 밀리크 물로 여러 번 부드럽게 헹굽니다. [시험관 바닥에 명백한 단백질 침전이 있는 경우 먼저 물을 넣고 피펫으로 불어내면 됩니다. 멤브레인을 만지지 않도록 주의하십시오. 침전물은 매달린 다음 도망갑니다. 수돗물로 씻을 수 없습니다. 0.2m NaOH 용액을 첨가한 후 실온에 20분 동안 두고 이 기간 동안 한외여과관의 균형을 맞춘다. 10분 더 원심분리합니다. 남은 NaOH 용액을 붓고 면심을 비이커(1 또는 2L) Milliq 물에 담그고 몇 시간 동안 담근 다음 새 물로 교체하고 몇 시간 동안 담가 두어 NaOH의 농도를 지속적으로 희석합니다. 50ml 시험관을 세척하고 수돗물로 덮고 내벽을 밀리크 물로 세척한다.

9. 담근 시험관 코어를 꺼내 full milliq 물에 넣고 50ml 시험관을 milliq 물로 채웁니다. 튜브 코어를 50ml에 천천히 넣습니다.

튜브를 원심분리하여 물을 빼내고 분리한 다음 뚜껑을 덮고 다음 사용까지 4도에서 보관합니다. 일반적으로 위의 단계와 예방 조치에 따르면 각 튜브는 3~4년 내에 파손되지 않습니다.