봉입체 정제에서 중공사의 몇 가지 독특한 방법에 대한 간략한 논의

봉입체(IB)는 외래 유전자가 원핵 세포, 특히 대장균에서 발현될 때 형성된 막으로 둘러싸인 고밀도의 불용성 단백질 입자입니다. 현미경으로 관찰하면 IB는 굴절률이 높은 영역으로 세포질의 다른 구성 요소와는 분명히 다릅니다.

봉입체 형성은 세포질의 단백질 생산 속도와 관련하여 상대적으로 복잡하고 새로 생성된 펩타이드의 농도가 높으며 접힐 시간이 충분하지 않아 무정형 단백질 응집체를 형성합니다. 봉입체는 기본적으로 단백질로 구성되어 있으며, 그 중 50% 이상이 복제된 산물입니다. 이들 제품의 기본 구조는 완전히 정확하지만 3차원 구성이 잘못되어 생물학적 활성이 없습니다. 봉입체 크기는 0.5-1μm이며 물에 불용성이며 요소, 구아니딘 염산염 등과 같은 변성제에만 용해됩니다.

E. coli에서 봉입체는 세포의 두 위치, 즉 세포질과 말초 세포질에서 발생할 수 있습니다. 세포 내 봉입체의 위치와 특성은 단백질이 어떻게 발현되는지에 따라 달라집니다.

대장균의 세포질 내 함유물은 일반적으로 직경이 {{0}}.2 ~ 1.5μm이며, 단백질마다 직경이 다릅니다. 예를 들어 인터페론의 크기는 0.811μm이고, 단백질의 크기는 0.811μm입니다. 프로렌넷은 1.281μm입니다. 어떤 경우에는 일부 봉입체의 직경이 대장균의 직경보다 커서 대장균이 돌출되는 경우가 있습니다. 일반적으로 세포에는 하나의 봉입체만 있습니다.

 

봉입체 정화

 

봉입체 정화 과정은 일반적으로 다음과 같습니다.

세포 분쇄:

세포 파쇄의 일반적인 기술은 고속 조직 파쇄, 유리 균질화기 균질화, 초음파 처리, 반복 동결-해동 방법, 화학적 처리(일반적으로 라이소자임 처리 사용)입니다.

 

포함 바디 세척:

봉입체는 일반적으로 무정형, 불용성 형태로 존재하는 박테리아에 의해 발현되는 단백질의 세포내 응집에 의해 형성된 비활성 고체 입자입니다. 봉입체에서 실제 표적 단백질은 약 50%만 차지하고 나머지에는 봉입체에 결합되어 봉입체 단백질의 재생에 영향을 미치는 지질, 지질다당류, 핵산 및 이종단백질이 포함되어 있습니다. 따라서 변성 전 세척은 매우 필요한 단계이다.

또한, 봉입체 세척은 재조합 단백질의 리폴딩 수율을 높이는 데 도움이 됩니다. 불순물을 제거하면 재생 과정의 장애물이 줄어들어 단백질이 보다 효율적으로 접히고 올바르게 조립될 수 있어 단백질의 활성과 기능이 향상됩니다.

일반적으로 사용되는 1% 미만의 중성 세제인 트윈(Tween), 트리톤(Triton), 요소(Urea) 및 NP40과 EDTA 및 환원제인 2-메르캅토트레이톨(DTT), -메르캅토에탄올을 여러 번 반복하여 세탁하면 세제의 세탁 능력이 향상되기 때문입니다. 용액의 이온 강도가 증가하면 봉입체 세척 시 NaCl을 첨가하여 이온 강도를 높일 수 있습니다.

봉입체는 원심분리 또는 여과를 통해 세포 분해 용액의 다른 성분을 제거하는 데 사용할 수 있으며, 두 방법 모두 봉입체의 서로 다른 물리적 특성을 활용합니다.

 

원심분리:

봉입체 단백질은 동일한 부피의 세포 단편보다 훨씬 밀도가 높으므로 봉입체는 원심분리를 통해 세포의 나머지 부분으로부터 분리될 수 있습니다. 연속 원심분리는 산업 생산에서 봉입체를 얻기 위해 가장 자주 사용되는 작업입니다. 세포조각의 밀도는 봉입체의 밀도보다 작기 때문에 침강속도는 봉입체의 밀도보다 작습니다. 지속적인 현탁 및 원심분리는 봉입체의 대부분을 원심분리할 수 있으며 세포 조각은 점차적으로 제거됩니다.
여과(접선유동여과) : 봉입체와 가용성 단백질의 분자 크기가 다르기 때문에 여과 방법을 사용할 수 있으며, 이는 운영 비용을 절감하고 규모 확장이 용이합니다. 접선유동여과(TFF)는 막횡단 압력차에 의해 구동됩니다. 막 공극 크기보다 작은 물질과 불순물은 막을 통과하는 반면, 입자가 큰 세포와 같은 불순물은 갇히게 됩니다. 여과 세척에 일반적으로 사용되는 막 구멍은 0.1μm입니다. 중공사 접선 흐름 미세 여과는 액체 물질의 높은 고체 함량, 더 적은 단계, 간단한 작동을 직접 처리할 수 있으며, 멤브레인은 모듈식 자동화 생산 요구 사항에 따라 세척을 통해 반복적으로 사용할 수 있으며 장비 투자 및 운영 비용을 절감할 수 있습니다.

 

다음은 Guidling 중공사막 컬럼을 이용한 봉입체 세척 적용 사례입니다.

94cm2 0.1-0.45μm 중공섬유를 사용하여 250mL 액체(목표 단백질 분자량 17kd)를 농축했습니다. 전체 세척 과정에서 목적 단백질의 회수율과 막 플럭스 고갈을 조사하였다.

0-71min은 농축 공정이고, 71-224min은 세척 및 여과 공정입니다. 전체 정밀여과 공정 동안 TMP는 점차 증가하고 액체 유입 속도는 변하지 않았으며 평균 재료 플럭스는 12LMH였습니다.

그 결과, 목적 단백질이 완전히 트랩되었으며, 목적 단백질의 회수율은 90% 이상인 것으로 나타났다. 가이딩 중공사막 컬럼은 안정적이며 이 응용 분야에 적합합니다.

 

봉입체 용해:

봉입체는 일반적으로 변성제인 요소 또는 구아니딘 염산염의 조건에서 용해되며, 용해된 봉입체 단백질은 완전히 변성된다. 즉, 1차 구조와 공유결합은 그대로 유지되고 모든 수소결합과 소수성 결합이 파괴되어 소수성이 된다. 사이드 체인이 완전히 노출되었습니다.

요소와 구아니딘 염산염은 중간 강도의 변성제이며 투석과 한외여과로 쉽게 제거됩니다. 요소 8-10M, 구아니딘 염산염 6-8M의 일반 농도. 요소 용해는 비이온화, 중성, 저비용이라는 장점이 있으며, 재생 후 단백질을 제거하면 다량의 단백질 침전이 발생하지 않으며, 용해된 봉입체는 다양한 크로마토그래피 방법으로 정제할 수 있으므로 널리 사용됩니다. .

 

봉입체 단백질 재접힘:

용해된 재조합 단백질은 기능성 단백질을 형성하기 위해 올바르게 접혀야 합니다. 재생 기술에는 단백질 용액을 중성 근처로 희석, 변성제 제거, 컬럼에서의 재생 및 겔 여과 크로마토그래피가 포함됩니다. 그 중 단백질 용액을 중성에 가깝게 희석하고 변성제를 제거하는 것은 일반적인 고전적 재생법이며, 특히 희석 재생법은 활용률이 가장 높다.

변성제 제거:

투석 : 부피가 증가하지 않는다는 장점이 있고, 외부투과액의 농도를 점차 감소시켜 변성제 제거율을 조절하지만, 시간이 오래 걸리고 불활성인 단백질 응집체가 형성되기 쉬워 투석에 적합하지 않다. 대규모 작업이므로 생산 규모에는 적용할 수 없습니다.

한외여과(TFF): 연구개발, 파일럿 테스트 또는 생산에서 투석 속도를 쉽게 제어할 수 있으며, 한외여과(TFF)를 통해 변성제(액체 변화 + 농도)를 제거할 수 있습니다.

 

봉입체 단백질 정제:

재생 후 단백질 정제 방법은 가용성 단백질 정제 방법, 즉 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 염석 침전 등의 방법과 유사합니다.

봉입체에는 생물학적 활성이 없으며, 단백질 활성 손실을 걱정할 필요가 없으며, 다량의 발현으로 인해 세포 사멸이 발생하지 않으며, 프로테아제 공격에 대한 저항력이 극대화됩니다. Jiuling 중공 섬유는 봉입체의 하류 정화 공정에 유연하게 적용될 수 있습니다. 봉입체 세척 단계에서는 원심 세척에 비해 우수한 성능을 발휘하며 접선 흐름 여과 세척에 9시대 기술 정밀 여과 중공사를 사용하면 공정 시간을 크게 단축할 수 있으며 일반 회수율은 90% 이상에 도달할 수 있습니다. Jiuling 중공 섬유는 봉입체의 단백질 재생 단계에도 사용할 수 있습니다. 정밀여과 중공섬유로 여과된 공급액의 탁도는 현저히 감소하고 단백질 회수율은 높습니다. 한외여과 중공섬유를 사용하면 변성제를 제거할 수 있을 뿐만 아니라 크로마토그래피 샘플 로딩 시간을 단축하여 시간을 절약하고 필러의 양을 줄이며 생산 비용을 줄일 수 있습니다. 정밀여과/한외여과 중공사의 회수율은 재료에 따라 다르며 일반적인 회수율은 90-95%에 도달할 수 있습니다.

Guidling Technology에서는 관련 리뷰를 위한 테스트 키트 요청을 환영합니다.

 

가이들링 소개

Guidling Technology는 바이오 의약품, 세포 배양, 바이오 의약품의 정제 및 농축, 진단 및 산업용 유체에 중점을 둔 국가 첨단 기술 기업입니다. 우리는 원심분리 필터 장치, 한외여과 및 정밀여과 카세트, 바이러스 필터, TFF 시스템, 심층 필터, 중공 섬유 등을 성공적으로 개발했습니다. 이는 바이오 의약품, 세포 배양 등의 응용 시나리오를 완벽하게 충족합니다. 당사의 멤브레인 및 멤브레인 필터는 사전 여과, 미세 여과, 한외 여과 및 나노 여과의 농축, 추출 및 분리에 널리 사용됩니다. 소규모 일회용 실험실 여과부터 생산 여과 시스템, 무균 테스트, 발효, 세포 배양 등에 이르기까지 당사의 다양한 제품 라인은 테스트 및 생산 요구 사항을 충족합니다. Guidling Technology는 귀하와의 협력을 기대하고 있습니다!