혈액제제의 불활성화 및 바이러스 제거 기술

Oct 24, 2024

혈액제제란 건강한 사람 혈장 또는 특히 면역이 있는 사람 혈장에서 분리한 사람 혈액 알부민, 사람 면역글로불린, 사람 응고인자(천연 또는 재조합) 적혈구 농축액 등과 같은 혈장 단백질 성분 또는 혈액 세포 성분을 정제하거나 정제한 것을 말한다. 진단, 치료 또는 수동적 면역 예방을 위해 재조합 DNA 기술로 만들어졌습니다. 혈액 제제는 의료 응급 상황, 전쟁 부상 구조, 일부 특정 질병의 예방 및 치료에 중요한 역할을 합니다.

안전 보장 관행에서는 최종 의약품이 규제 기관, 궁극적으로 환자와 대중에게 안전하다는 것을 보장해야 합니다. 1990년대 국제 조정 회의(ICH 1998)에서는 "Q5A: 인간 또는 동물 유래 세포주의 생명공학 제품에 대한 바이러스 안전성 평가"(Q5A: 바이러스 안전성 평가)를 발표하여 바이러스 안전성에 대한 세계적인 표준을 확립했습니다.

ICH Q5A에는 이 목표를 달성하기 위한 테스트 및 검증을 위한 다단계 체계가 설명되어 있습니다. 테스트 프로그램은 제품 위험 분석으로 보완된 세포 은행, 원료 및 생물반응기 수확에 중점을 둡니다. 테스트 외에도 ICH Q5A에서는 업스트림에서 오염물질이 검출되지 않을 때 다운스트림 오염 제거를 안전한 조치로 평가하도록 요구합니다. 클리어런스 검증을 통해 테스트 체제를 벗어난 바이러스가 최종 의약품에 도달하기 전에 제거 및/또는 비활성화될 수 있음을 보장합니다.

현대 생명공학 제조(또는 생물공정)에는 바이러스를 제거하거나 비활성화할 수 있는 전체 정제 순서에 일반적으로 3~4개의 단위 작업이 있습니다. 여기에는 특정 크로마토그래피 단계(예: 단백질 A 또는 음이온 교환), 낮은 pH 또는 세제 배양, 바이러스 보유 필터가 포함됩니다. 이러한 모든 단계가 모든 바이러스를 효과적으로 제거하거나 비활성화하는 것은 아닙니다.

예를 들어, 낮은 pH 배양은 일반적으로 비외피 바이러스 불활성화에는 효과적이지 않지만 외피 바이러스 불활성화에는 잘 작동합니다. 특정 작동 조건에서 음이온 교환 컬럼은 제품 스트림에서 중성 등전위 바이러스를 결합 및 제거할 수 없지만 산성 바이러스에는 효과적입니다.

이는 생명공학 제품의 바이러스 안전성을 함께 보장하는 3~4개의 독립적이고 직교적인 단위 운영의 조합입니다.

일반적으로 견고하고 효율적이며 신뢰할 수 있는 처리 단계를 통해 많은 수의 바이러스(일반적으로 4 log10 이상으로 정의됨)를 제거하거나 비활성화할 수 있다고 가정합니다. 여기서 로그 감소 값 또는 LRV는 전체 바이러스의 log10으로 계산됩니다. 입력의 바이러스 수를 출력의 총 바이러스 수로 나눈 값입니다. 그러나 LRV는 단계의 효율성을 측정하는 단일 절대 척도로 사용할 수 없습니다. 데이터는 예비적일 수 있습니다. 모델링이 쉽고 공정 조건 변화에 상대적으로 둔감하며 다양한 바이러스에 효과적입니다(WHO 2004).

바이러스 여과는 강력하고 효과적인 공정 단계로 널리 인식되고 있으며 생명공학 제품 제조 과정에서 외인성 및 내인성 바이러스 입자의 위험을 최소화하기 위한 전체 전략의 핵심 구성 요소입니다.

바이러스 필터는 크기에 따른 강력한 보존 메커니즘을 통해 작동하는 경우가 많습니다. 이러한 강력한 작용 메커니즘을 기반으로 바이러스 필터는 크로마토그래피 단계보다 다양한 바이러스에 대해 예측 가능한 바이러스 보유를 제공할 가능성이 더 높습니다. 이는 필터가 다양한 바이러스의 물리화학적 특성 차이와 작동 조건에 따라 규제되는 바이러스-수지 상호 작용의 영향을 받을 가능성이 적기 때문입니다. 따라서 바이러스 여과 단계는 잘 설계된 재조합 치료 단백질 정제 공정(EMEA 1996)에 일반적으로 사용되며, 이는 혈장 처리 산업에서도 강력한 성능을 갖는 것으로 나타났습니다.

그러나 혈액제는 양날의 검과 같아서 수천 명의 생명을 구할 뿐만 아니라 질병을 퍼뜨리고 인류의 건강을 위협할 가능성도 있습니다. 통계에 따르면, 1977년부터 1984년까지 미국에서 최소 30,{4}}명의 수혈자가 AIDS 바이러스에 감염된 혈액을 받았습니다. 1985년에 프랑스의 혈우병 환자 3명 중 1,200명000이 수혈이나 혈액 제제를 통해 AIDS에 감염되었습니다.

세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계 AIDS 감염의 5~10%는 AIDS에 감염된 혈액이나 혈액 제제의 수혈로 인해 발생합니다. 중국에서 첫 번째 AIDS 사례는 AIDS 바이러스에 감염된 수입 혈액제제를 사용하여 감염되었습니다. 또한, 혈액 및 혈액 제제 수혈로 인해 B형 간염 및 C형 간염이 전염되는 사례도 보고되었습니다.

1. 혈액제제를 통해 전파되는 주요 바이러스와 그 특성

혈액 및 혈액제제를 통해 전파되는 바이러스의 종류는 표 1과 같이 다양하다. 그 중 HIV, HBV, HCV는 높은 감염률과 심각한 피해로 인해 국내외 의료계에서 우려를 불러일으키고 있다.

혈액 및 혈액 제제는 바이러스를 퍼뜨릴 가능성이 있기 때문에 질병 예방 및 치료에 적용하는 데 심각한 영향을 미쳤습니다. 따라서 혈액제제 생산 시에는 혈액제제의 안전성을 확보하기 위해 바이러스 불활화 및 제거 공정이 추가되어야 한다.

2. 바이러스의 비활성화 및 제거의 주요 방법

혈액제제의 안전성을 보장하기 위해서는 헌혈자 선정, 가능한 경우 예방접종, 수집된 혈액에 대한 엄격한 검사 및 기타 조치 외에도 혈액제제의 바이러스 치료 불활성화 및 제거는 혈액제제의 안전성을 보장하는 중요한 연결고리입니다. 수혈의 안전성. 바이러스를 비활성화하고 제거하기 위해 일반적으로 사용되는 몇 가지 효과적인 방법이 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

이 방법의 이론적 근거는 온도와 작용시간의 선택을 통해 바이러스 구조의 파괴율이 단백질 구조의 파괴율보다 훨씬 높다는 것입니다. 거의 50년간의 임상적 사용 결과와 최근의 동물 실험을 통해 60도, 10시간 가열 처리, 즉 파스퇴르 소독 후 용액 중의 알부민이 HBV를 비활성화할 뿐만 아니라 HCV, HIV도 비활성화할 수 있어 알부민을 가장 신뢰할 수 있는 것으로 확인했습니다. 바이러스 안전에 대한 혈액 제품.

최근 파스퇴르의 공정은 IVIG, FVI, FIX, 피브리노겐 및 기타 제품 생산으로 확장되었습니다. Bridonnccuet al. 저온에탄올 생산 IVIG 공정에 이 바이러스 불활성화 공정을 추가한 것이다. 즉, 안정제 무첨가, 저염, 산도 조건에서 파스퇴르법을 시행해 바이러스 역가가 5 Log 감소했다. Simmondset al. 영국에서 임상적으로 사용되는 FVIII 및 FIX 농축제제의 수혈전염바이러스(TTV)를 테스트한 결과, 파스퇴르 바이러스 불활성화 처리를 하지 않은 제품의 TTV 검출률은 5{5}}%~75%, 양성 검출률을 확인하였습니다. 파스퇴르 불활성화 후 제품의 비율은 0이었습니다.

TTV 양성률은 비불활성화 응고인자 제품을 사용한 영국의 84명의 혈우병 환자에서 27%였으며, 바이러스 불활성화 응고인자 제품을 사용한 환자 19명 중 1명만이 양성이었으며 양성 검출률은 5%였습니다. 따라서 바이러스 불활성화 과정은 혈액제제의 안전성을 향상시키는데 매우 효과적이다.

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. S/D법에 의해 불활화되는 다수의 혈액제제는 장기간의 임상 적용을 통해 안전성과 신뢰성이 입증되어 널리 사용되고 있습니다. 그러나 이 방법은 파보바이러스 B19, HEV 및 기타 비지방 코팅 바이러스에 대한 불활성화 능력이 없습니다.

건열 불활성화란 동결건조 제제를 가열 처리하고 바이러스를 건열로 사멸시키는 것을 의미합니다. 일반적으로 사용되는 건열 방식은 6{21}}도 ~80도, 10~72시간 가열 방식과 80도, 72시간 처리 방식이 있습니다. 1980년대 초반부터 FVIII 동결건조 농축 제제와 프로트롬빈 복합체를 60~80도에서 10~72시간 동안 가열하는 것이 유용했습니다. 그러나 이 방법으로는 HBV, HCV, HIV를 완전히 비활성화시킬 수는 없다는 것이 입증되었습니다. 80도, 72시간의 건열 처리는 HBV, HCV 및 HIV를 비활성화하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 100도에서 처리된 응고 인자의 동결건조 제제에 대한 최근 보고도 있었습니다. Xu Jinbo 등은 IgG를 100도에서 30분 동안 처리하고 수포성 구내염 바이러스 8.2 Log를 비활성화했습니다. 어떤 사람들은 건조 상태에서 68도에서 72시간 동안 FVIII를 동결 건조시킨 후 100도에서 0.5~1시간 동안 가열합니다. 이 방법은 비교적 경제적입니다.

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 HIV에 결합된 세포의 로그와 혈소판은 시험관 내 기능 보존 7일 후에도 양호하게 유지되었으며 이는 FDA의 임상 시험 승인을 받았습니다.

이들 방법 중 파스퇴르 소독법과 S/D법은 미국 FDA의 승인을 받아 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. 건열 불활성화 방법은 주로 동결건조 제제의 바이러스 불활성화에 적합합니다. 광화학적 방법은 지질로 코팅된 바이러스에 대해 강력한 불활성화 효과가 있으며 유럽에서는 전혈장 바이러스 불활성화에 사용되어 왔으며 혈액 세포 구성 요소에서 바이러스 불활성화에 대한 광범위한 전망을 가지고 있습니다. 그러나 이러한 모든 방법에는 파스퇴르 멸균이 일부 내열성 바이러스를 비활성화하는 데 이상적이지 않다는 단점이 있습니다. S/D 방법은 리포 코팅되지 않은 바이러스를 효과적으로 비활성화할 수 없습니다. 광화학적 방법은 일부 혈장 단백질의 활성을 크게 손상시켰습니다. 후속 조사의 현재 임상적 사용은 어떠한 바이러스 불활성화 방법도 혈액 제제가 바이러스 전파 위험으로부터 완전히 자유롭다는 것을 보장할 수 없음을 보여줍니다.

혈액제제 생산 시 한 번의 비활성화 공정으로 모든 바이러스를 비활성화할 수는 없습니다. 또한, 바이러스 자체는 이종 단백질이므로 제품에 투입하면 부작용이 발생합니다. 동시에 기술 수준의 한계로 인해 특성이 발견되지 않거나 이해되지 않는 바이러스가 여전히 존재하므로 기존 바이러스 비활성화 방법으로는 이러한 바이러스의 비활성화 효과를 보장할 수 없습니다. 따라서 비활성화만으로는 제품의 안전성을 보장할 수 없으며 제품에서 비활성화해야 합니다. 그래서 바이러스 제거 기술이 점점 주목을 받고 있습니다. 일반적으로 사용되며 효과적인 두 가지 바이러스 제거 프로세스가 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.

크로마토그래피 기술은 다양한 구성 요소의 분리를 달성하기 위해 다양한 구성 요소와 고정상 친화력 또는 상호 작용 차이를 사용하는 것을 의미합니다. 크로마토그래피는 혈액제제 생산을 위한 첨단기술로서 그 자체로 바이러스를 제거하는 효과가 있으며, 특히 친화성 크로마토그래피와 이온교환 크로마토그래피는 더욱 그러하다. 이온 교환 크로마토그래피의 경우 용출은 바이러스 제거에 있어서 침투에 비해 장점이 있습니다. 표 2는 호주 CSL Company의 알부민 생산과정에서 크로마토그래피 기술에 의한 HAV 제거율에 대한 데이터 통계를 보여준다. 표 2에서 볼 수 있듯이, 이온 교환 크로마토그래피와 겔 여과는 HAV 제거에 더 효과적이며 총 제거율은 10.9 Log입니다.

FVIII 생산 시 Baxter Healtheare는 항 FVIII 항체 처리 젤을 사용하여 면역친화성 크로마토그래피를 수행합니다. 이는 비 FVIII에서 (4.2±{4}}.1)Log 및 (5.3±0.9)Log를 제거할 수 있습니다. - PPV 및 HAV와 같은 지질 코팅 바이러스.

HAV 및 파보바이러스 B19와 같이 표면 직경이 작은 일부 바이러스의 경우 나노막 여과가 가장 효과적인 제거 방법입니다. 단백질과 바이러스의 크기 차이와 필터막에 의한 바이러스 흡착을 이용하여 바이러스를 분리하는 방식입니다. 프로트롬빈 복합체 생산 공정에 1단계, 2단계 Planova 15N 나노막 여과를 추가하여 바이러스를 제거하는 실험실 연구가 네덜란드의 Sanquin 혈액 공급 현장에서 수행되었습니다. 나노막 여과 후 HIV, HAV 및 기타 바이러스의 제거율이 다양한 정도로 증가한 것으로 나타났습니다(표 3 참조).

그러나 이 방법을 산업생산에 적용할 경우 다음과 같은 문제가 발생할 수 있다. 첫째, 제품의 점도가 높고 직경이 큰 단백질이 존재하기 때문에 필터가 선정하는 막의 기공크기가 너무 작지 않아야 하며, 따라서 HCV와 같은 소구경 바이러스의 제거를 제한합니다. 둘째, 필터 생산 과정에서 막공 크기 조절의 안정성이 바이러스 제거에 영향을 미치게 된다. 셋째, 바이러스 입자의 직경보다 작은 막 구멍이 막히면 제품 유속이 감소하여 수율에 영향을 미칩니다. 따라서 가공된 제품의 요구에 적합한 특성과 기공 크기를 갖는 멤브레인을 선택하는 것은 나노멤브레인 여과가 바이러스를 제거할 수 있는지 여부를 결정하는 중요한 요소입니다.

혈액원의 품질을 보장한다는 전제하에 바이러스의 불활화 및 제거 과정은 혈액제제의 안전성을 보장하는 중요하고 필요한 수단입니다. 하나의 비활성화된 바이러스 공정만을 사용하는 것은 혈액제제의 안전성을 절대적으로 보장할 수 없습니다. 바이러스 불활성화 기술을 바탕으로 크로마토그래피, 나노필름여과 등의 바이러스 제거 기술을 추가해 바이러스 제거율을 대폭 높이고, 바이러스 불활성화 및 제거 효과를 대폭 향상시켰다. 현재 유럽에서는 혈액제제 생산 과정에서 혈액제제의 안전성을 보장하기 위해 최소한 한 번의 바이러스 불활성화 및 제거 과정을 거쳐야 한다고 분명히 제안했습니다.

중국의 경우 대부분의 혈액제제 제조사들이 생산과정에서 파스퇴르 소독법, S/D법 등 한 가지 불활화 바이러스 공정만 사용하고, 바이러스 제거 공정은 사용하지 않아 혈액제제 품질에 심각한 영향을 미치고 있다. 중국이 WTO에 가입함에 따라 국내 혈액제제의 생산공정과 품질표준은 세계와 일치하게 된다. 그렇지 않으면 기존 국내 시장점유율을 보장할 수 없을 뿐만 아니라 세계 각국의 유사 제품과 경쟁할 수도 없다. 국제 시장.

따라서 중국의 혈액제제 제조업체는 생산 공정을 개선하고 바이러스의 비활성화 및 제거를 강화하여 제품의 품질과 안전성을 완전히 보장해야 합니다. 따라서 중국 혈액제제 제조업체에서는 혈액제제의 안전성을 보장하기 위해 크로마토그래피를 사용하여 혈액제제를 정제하고 바이러스를 제거하는 것이 추세가 될 것입니다.

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