요약:

이 기사는 단백질 정제 전략에서 고려해야 할 두 가지 주요 요소, 즉 다운 스트림 적용 요구 사항과 단백질 자체의 생물학적 특성을 검토합니다. 이 기사는 고품질 단백질 정제가 특히 재조합 단백질의 생산을위한 실험 데이터의 신뢰성 및 반복성을위한 기초라고 강조한다. 다른 응용 시나리오는 단백질 순도, 활성 또는 내 독소 함량에 대한 특정 요구 사항이 있으며, 단백질 특성은 정제 전략에 크게 영향을 줄 수 있습니다. 특정 사례에 따르면,이 기사는 독특한 단백질이 맞춤형 정제 체계를 채택해야한다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 체계적인 단백질 생산 공정이 제안되었으며 (그림 1), 발현 시스템 선택, 시공 설계에서 정제 최적화에 이르기까지 전체 프로세스 품질 관리를 강조하고 생물 물리학 기술 (SEC-MALS, DSF 등)을 통한 단백질 균질성 및 기능의 평가를 권장합니다. 이 기사는 연구자들에게 실질적인 지침을 제공하여 표적 단백질의 특성 및 적용 요구 사항에 따라 효율적이고 반복 가능한 정제 전략을 공식화하여 과학 연구의 품질과 효율성을 향상시키는 것을 목표로합니다.

 

그림 1. 단백질 생산 공정의 개략도

 

고음 단백질 생산 - 문제 식별, 완화 전략 설계 및 해당 출력의 예

 

1. 단백질에 대한 핵산 결합 :

핵산 결합 단백질을 정제 할 때, 핵산 오염을 제거하기 위해서는 다수의 단계가 필요하다. 용해 동안, 뉴 클레아 제 (SM 뉴 클레아 제 (Benzonase®) 또는 DNase 또는 RNase)를 첨가 할 필요가 있지만 결합 된 핵산은 완전히 제거 될 수 없다. PEI 또는 스트렙토 마이신 설페이트 침전물, 헤파린 정제 또는 이온 교환 크로마토 그래피와 같은 핵산 제거 단계를 대체하십시오. 핵산의 존재는 정제 과정 전체에 걸쳐 A26 0 nm\/a28 0 nm의 비율에 의해 모니터링되었다. 비율이 0.6보다 낮은 경우, 단백질 순도가 비교적 높고 핵산 오염이 최소임을 나타 냈습니다. 강하게 결합 된 핵산을 갖는 단백질의 경우, 일시적으로 변성 (예 : 우레아로 처리 된)을 삭제할 수 있습니다. 핵심 사항 : 고품질 시약, 신선한 버퍼 및 청정 기둥을 사용하십시오 (사용하기 전에 0.5m NaOH로 청소).

 

2. 마우스 페리틴 중쇄 :

정제 된 마우스 페리틴 중쇄 (MFTH1) 단백질을 생산하는 목적은 고해상도 단일 입자 냉동 전자 현미경 (Cryo-EM)이다. 대장균 발현 벡터를 암호화되지 않은 MFTH1은 어떤 뉴 클레아 제도 첨가하지 않고 초음파 적으로 파괴되었다. 7 0 정도에서 가열 한 후, 황산 암모늄 침전, 투석 및 크기 배제 크로마토 그래피 단계를 받았다. 생성 된 샘플은 냉동 전자 현미경 이미지에서 다량의 오염 물질의 존재를 보여 주었고 (도 2A), 이는 적용에 완전히 부적합했다. 단계를 최적화하십시오. 황산 암모늄 침전 후 세포 용해 공정 및 투석 공정 동안 SM 뉴 클레아 제를 추가 한 다음 음이온 교환 크로마토 그래피 단계를 추가하여 A26 0 NM\/A280NM의 비율을 1.4에서 0.8로 줄입니다. 크기 제외 크로마토 그래피 후, 최종 MFTH1 샘플의 A260NM\/A280NM의 비율은 0.56이었다. SDS-PAGE 및 냉동 전자 현미경 이미지 (도 2B)는 단백질이 매우 순수하다는 것을 보여 주었고, 이는 오염 물질이 효과적으로 제거되었음을 나타낸다.

그림 2 마우스 페리틴 중쇄

 

 

 

3. 키메라 단백질 인간 dsrbec (dsrbd-egf-chimera) :

DSRBEC는 인간 단백질 키나제 R 및 인간 표피 성장 인자 (HEGF)의 이중 가닥 RNA 결합 도메인 (DSRBD)의 융합에 의해 형성된다. DSRBD가 대장균으로 발현 될 때, 이는 매우 높은 dsRNA 결합 능력을 보여준다. 세포 용해 후, 오염 물질 RNA는 고정 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC) 컬럼에 재조합 단백질의 결합을 방해 할 것이다. PEI 또는 스트렙토 마이신 설페이트 침전, RNase 처리 또는 고염 완충액과 같은 기존의 방법은 RNA를 제거 할 수 없습니다. 4M 요소를 함유하는 완충액을 사용하여 세포 용해를 수행 하였다. 상청액을 IMAC 컬럼에로드하고, 4m ~ 0 m 요소를 밤새 천천히 사용 하였다. Renaturation 완충액을 이미 다졸과 함께 첨가하고 IMAC 컬럼에서 용출시켰다. 최종 정제는 기능적으로 활성 DSRBEC를 얻기 위해 SuperDEX 75 겔 여과를 통해 수행되었다.

 

4. 단백질은 2가 양이온 또는 다른 보조 인자에 결합 된 단백질 :

Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ 또는 다른 보조 인자와 같은 2 개의 이성 양이온과 상호 작용하는 단백질의 경우, 발현 중에 특정한 양이온 (또는 다른 보조 인자)을 추가하는 것이 중요합니다. 정제 과정에서 소량의 동일한 이성 양이온 (또는 다른 보조 인자)도 필요합니다. 그러나 킬레이트 제 (예 : EDTA, EGTA) 및 킬레이트 감소 제 (예 : DTT 또는 DTE)의 사용을 피해야합니다. 분광제가없는 단백질을 처리 할 때, 킬레이트 제없는 프로테아제 억제제의 혼합물을 사용하여 분광법 (원자 흡수 분광 학체)을 통해 정제 된 단백질에서의 실질적인 양이온 (또는 다른 보조 인자)의 실제 존재를 확인해야한다.

 

5. 열구 성 시아 노 박테리아 mastigocladus laminosus로부터 단일 [2fe ± 2s] 클러스터를 함유하는 재조합 페리 독신 (RFD)

페리 록신은 전자 전달 반응에 참여하는 가용성 철-황화 단백질입니다. 식물 유형 페로 레 독신은 광 시스템 I의 전자 수용체로서 단일 [2fe ± 2s] 클러스터를 운반한다. 대장균 Coli BL21 (DE3) 균주는 10mm FECL3 및 항생제를 함유하는 TB 배지에서 재조합 RFD 단백질을 발현시켰다. IMIC 캡처 컬럼의 용리를 10mm 히스티딘을 함유하는 완충제를 사용하여 이미 다졸을 피하고 [2FE ± 2S] 클러스터의 파괴를 방지 하였다. 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여 결정화 스크리닝을 위해 추가 정제 및 12mg\/mL로의 농도를 사용 하였다. 페레 독신의 재조합 생산과 비교하여, 청록색 조류 마스티고 클라 디스 라미노스로부터 정제 된 천연 페 루 독신은 결정화 동안 더 높은 해상도를 달성했다.

 

6. 항원으로 사용 된 단백질

단백질은 종종 표적 특이 적 리간드를 회수하기 위해 항원으로 사용됩니다. 가장 먼저 고려해야 할 것은 단백질이 생체 내 면역에 사용되어 기존의 단일 클론 또는 폴리 클로 날 IgG를 얻기 위해 또는 낙타 IgG 또는 시험 관내 선택 과정을 포함하는 프로그램에 사용되는지 여부입니다.

 

6.1 일상적인 항체 생산에 사용되는 항원

항원이 단일 클론 IgG 항체를 생성하는데 사용될 때, 항원의 정확한 접힘은 일반적으로 필요하지 않다. 왜냐하면 대부분의 모노클로 날 항체는 항원의 구조에 의해 크게 영향을받지 않는 선형 에피토프를 인식하고, 심지어는 항원 (포함 신체 단백질과 같은)도 효과적이다. 그러나, 순도는 면역 반응을 방해하고 비 표적 항체의 우세를 유발하는 강한 면역 원성 오염 물질을 피하기 위해 엄격하게 제어되어야한다.

 

6.2 Conjugate 라이브러리의 스크리닝

낙타 면역에 의해 얻은 나노 바디 라이브러리의 가공 동안 항원의 자연 형태를 유지하기 위해 특별한주의를 기울여야한다. 기존의 항체와 달리, 낙타 항체 (특히 나노 바디)는 고유 한 볼록 보완 부위 구조와 관련된 구조적 에피토프를 인식하는 경향이 있습니다. 유사하게, 시험 관내에서 큰 합성 또는 천연 항체 라이브러리를 선별 할 때, 항원은 표적 적용과 완전히 일치하는 구조를 유지해야한다. 스크리닝 과정 자체가 바이어스되지 않기 때문에, 항원이 잘못 접힌, 응집 또는 구조적 이질성을 갖는 경우, 비 천연 에피토프를 표적으로하는 다수의 컨쥬 게이트가 스크리닝 될 수있다.

 

 

 

7. 분자간 또는 분자 내 이황화 결합 또는 유리 시스테인을 함유하는 단백질

이황화 결합은 단백질의 자연 구조를 안정화시키는 데 중요합니다. 정제 과정 동안, 분자간 또는 분자 내 이황화 결합을 함유하는 단백질을 정제 할 때, 단백질의 형태 변화를 방지하기 위해 환원제를 첨가하지 않아서 그들의 기능을 변화시킨다. 유리 시스테인을 함유하는 단백질의 경우, 감소 제는 인공 이황화 결합의 형성을 방지하기 위해 정제 과정의 모든 단계에서, 특히 저장 중에 정제 과정의 모든 단계에서 없어서는 안될이다. 가장 일반적으로 사용되는 환원제는 Dithiothreitol (DTT), -mercaptoethanol (-me) 및 Tris ({2- Carboxyethyl) 포스 핀 하이드로 클로라이드 (tce)입니다. DTT 또는 TCEP와 호환되지 않는 IMAC 수지의 경우 -me를 사용하여 후속 단계에서 다른 환원제로 교체하는 것이 좋습니다.

 

8. 재조합 항체 단편

재조합 항체 단편 (예 : 나노 바디)의 구조는 IgG의 구조보다 간단하지만, 이들의 기능은 이황화 결합의 올바른 형성에 의존한다. 박테리아 발현 시스템에서, 최적화 전략의 채택에도 불구하고, 가용성 부분과 포함 본체에 존재하는 잘못 접힌 또는 부분적으로 접힌 생성물이 여전히 발생할 수있다. 더 은폐 된 항체 단편조차도 표면의 소수성 플라크를 통해 가용성 응집체 (콜로이드 응집)를 형성 할 수 있다는 것이다. 이러한 응집체는 일상적인 기능 테스트 (예 : ELISA)에서 식별하기가 어렵다. 다중 결합은 단량체 친화력의 감소를 가릴 수 있지만, 이들의 존재는 소분자 크기 (예 : 초-해상도 현미경)에 의존하는 응용에 심각한 영향을 줄 수있다. 따라서 SDS-PAGE에만 의존하는 것은 샘플 품질을 평가하기에 충분하지 않습니다. 겔 여과와 같은 생물 물리학 적 방법 (도 3)은 모노머 (주 피크)를 골재 (제외 부피 피크)와 구별하기 위해 채택되어야한다. 주요 제어 지점에는 다음이 포함됩니다 : 이황화 결합 형성을 촉진하기 위해 발현 중 산화 환원 환경을 최적화하고 정제 후 스토리지 조건을 최적화하여 응집을 방지합니다. 이러한 조치는 항체 단편의 단 분산 및 기능을 보장하는 데 중요합니다.

그림 3. 나노 바디의 가용성 응집체의 겔 여과 분리

 

림프구 수용체 LLT1의 가용성 단편

이황화 결합-의존성 단백질 (예 : 림프구 수용체 LLT1)의 재조합 발현은 종종 폴딩 어려움에 직면한다. 야생형 LLT1의 겔 여과는 응집 피크 및 이량 체 피크 (도 4A)를 나타내었지만 (도 4A), 질량 분석법은 이량 체에서 짝을 이루지 않은 시스테인에 의해 야기 된 미스 폴딩을 나타냈다 (도 4B). 이 목적을 위해, 두 개의 돌연변이 체가 설계되었다 : 하나는 문제를 제거하여 갑자기 수율이 떨어졌다 (도 4A); 핵 이황화 이황화 결합을 재구성하기 위해 네오 시스테인이 도입 한 후, 돌연변이 체는 높은 수율 및 우수한 안정성을 가질뿐만 아니라 결정화 할 수 있었으며 (도 4C), 3D 구조는 돌연변이 체가 정확한 이황화 결합을 형성하고 자연 접힘을 유지했음을 확인 하였다. 이 사례는 겔 여과 및 질량 분석법과 결합 된 합리적으로 적합성 이황화 결합을 합리적으로 설계함으로써 재조합 단백질의 폴딩 문제가 효과적으로 해결 될 수 있고, 안정적인 구조 및 높은 수율을 갖는 기능적 단백질을 얻을 수 있음을 입증한다.

그림 4. 이황화 결합 재구성은 가용성 LLT1의 폴딩 및 수율을 향상시킵니다.

 

 

 

10. 쉽게 응집 가능한 단백질

재조합 단백질의 정제는 종종 응집 문제에 직면하고, 그 형성은 "핵 생성 성장"메커니즘을 따른다. 이러한 도전을 해결하기 위해서는 다단계 전략이 채택되어야합니다. 발현 단계에서, 이는 변형을 최적화하고, 배양 온도를 줄이고, 변형 된 배양 배지 또는 상이한 가용성 융합 단백질을 사용하고, 발현 시스템 (곤충\/포유류 세포)을 대체함으로써 달성 될 수있다. 정제 단계에서 (4도 C 환경에서) 급속한 공동성을 피하기 위해서는 급속한 작동이 필요하다. Sec)는 즉시 골재 핵을 제거하기 위해 채택되어야합니다. 일반적으로, 버퍼 용액을 선별 할 때, 성분 조성, pH 값, 해리 제 또는 가용 화제와 같은 인자를 고려해야한다 (도 5). 직교 검출의 미세 최적화 (예 : SEC, CD, LS, DSF 및 형광 열 등을 기반으로 한 온도 이동)를 통해 단백질 품질 및 가장 적합한 완충액을 결정했습니다.

그림 5. 단백질 응집을 완화하기위한 전략

 

11. 인간 CLK1 키나제의 결정화 (재현 가능한 배치를 얻는 방법)

결정화 연구를위한 균질 한 비 인산화 된 CLK1 키나제를 수득하기 위해, 다국적 공동 협력 체계가 채택되었다. 첫째, 대장균에서 λ- 포스파타제와 공동 발현하여자가 인산화의 이질성을 제거 하였다. 수율이 감소했지만 완전한 탈 인산화가 보장되었다. IMAC에 의해 포획 된 후, 용리액에 응집을 방지하고 농축을 방지하기 위해 안정제 (50mm 아르기닌, 50mm 글루탐산 및 10mm DTT)를 보충하고 TEV 소화에 의해 그의 태그를 제거 하였다. 이어서, 정확한 올리고머를 SEC (5% 글리세롤 및 -ME 함유)로 분리 하였다. 최종 결정적인 음이온 교환 단계는 결정질 (비 인산화) 및 비 결정 (부분적으로 인산화 된) CLK1 그룹을 구별합니다. 세포 용해의 모드는 단백질 안정성에 크게 영향을 미친다는 점은 특히 주목할 가치가 있습니다. 고압 및 고온 방법은 CLK1의 돌이킬 수없는 응집으로 이어져 키나제 제조에 대한 가벼운 처리의 중요성을 강조합니다.

 

 

 

12. 안정적인 리간드 결합 능력으로 갈 렉틴 -1을 생산합니다

리간드 결합 연구에 대한 기능적 갈크 틴 -1를 제조하기 위해, 4 가지 구조물의 발현 및 정제 전략 (표지되지 않은 야생형 갈크 틴 -1, unlabeled 및 His-labeled cysteine ​​freat galectin -1)의 발현 및 정제 전략을 비교 하였다. 주요 결과는 유당 친 화성 크로마토 그래피 정제 정제가 정확하게 접힌 단백질을 효과적으로 스크리닝 할 수 있지만, 결합 부위에서 유당을 완전히 제거하고 CRD 활성을 복원하기 위해 철저한 투석 (HEPES 완충액)과 결합되어야한다는 것을 나타냅니다. 야생형 갈 렉틴 -1는 산화 및 불 활성화가 발생하기 쉽고, 감소 제의 존재 하에서도 안정성은 제한적이다 (도 6). 그러나, 시스테인이없는 돌연변이 체는 이황화 결합 의존성을 제거함으로써 비슷한 응집 활성 및 열 안정성 (NanoDSF, ITC 등에 의해 검증)을 유지하면서 장기 안정성을 크게 향상시킨다.

그림 6. 재조합 galectin의 유체 역학적 특성 -1은 그 불안정성을 나타냅니다.

 

13. 내 독소 제거

내 독소 제거 방법은 양으로 하전 된 크로마토 그래피 (음이온 교환), 폴리 양이온 성 리간드 (예 : 폴리 -L- 리신 (PLL), 고정화 된 폴리 아민 (폴리 믹신 B))의 사용 및 계면 활성제 트리톤 x -114의 첨가를 포함한 친 화성 크로마토 그래피에 기초한다. 정제 과정에서 LPS가없는 물로 완충액을 준비하는 데주의를 기울이고 다른 LPS가없는 정화에만 사용 된 새로운 기둥이나 기둥을 사용하십시오. 내 독소 오염의 경우, 크로마토 그래피 펌프\/유체 시스템은 밤새 0. 5M NaOH 또는 1에서 4 시간 동안 인큐베이션 될 수 있습니다. 0 m NaOH. 샘플에서 LPS의 최종 양은 LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE 시약 (LAL)을 사용하여 평가되었으며, 특정 응용 분야에 필요한 한계보다 낮은 지 여부를 확인 하였다.

 

14. 단백질 복합체

단백질 복합체의 발현 및 정제는 특정 조건에 따라 최적화되어야한다. 도전에는 서브 유닛의 불안정성 또는 잘못된 폴딩이 포함됩니다. 각각의 서브 유닛은 독립적으로 발현되고 시험 관내에서 조립되거나, 기능성 단백질 복합체를 형성하기 위해 공동 발현 될 수있다. 특히 복잡한 정보가 제한되어 있고 다중 최적화가 필요한 경우 조립을 방해하지 않도록 정제 또는 탐지 라벨로 구성 설계를 신중하게 도입해야합니다. 정제 과정에서 복합체의 완전성과 안정성을 평가해야합니다. 이 방법에는 SDS-PAGE (서브 유닛 검출), SEC (균질성), SEC-MALS (몰 질량 분석), 질량 광도 또는 자연 질량 분석법 (질량 검증)이 포함됩니다. 복합체는 낮은 농도로 분리 될 수 있습니다. 이 시점에서 크로마토 그래피 방법 또는 완충액 (예 : 열 드리프트 또는 DSF 스크리닝 조건)을 최적화해야합니다. 또한, 정제 단계를 줄이면 약한 상호 작용 서브 유닛의 손실을 방지하고 복합체의 정제 효율 및 완전성의 균형을 유지할 수있다.

 

 

 

15. 항원-항체 복합체의 정제

항체-항원 복합체는 단백질 복합체의 전형적인 예이다. 그들의 공동 결정은 결합 패턴을 나타내고 항체 공학의 최적화를 안내 할 수있다. 전통적인 방법은 항원과 항체의 별도의 정제를 필요로합니다. 그러나, 최근의 연구에 따르면 공동 발현 및 공동 정류 전략이 더 효율적임을 보여 주었다. 복합체를 얻기 위해서는 단일 정제 만 필요하며 동시에 불안정한 항원은 항체를 통해 안정화 될 수 있으며, 라벨이없는 발현조차도 달성 될 수있다. 이러한 특정 상황에서, SDS-PAGE 및 겔 여과 (SEC)는 일반적으로 복합체의 순도 및 품질을 평가하기에 충분하다.

 

요약

단백질 정제는 과학 연구의 기본 기술입니다. 학문적 규모의 단백질 생산은 일반적으로 표준 전략을 따르며 구조적 생물학, 생화학 및 기능적 연구에 널리 사용되는 밀리그램 수준의 고순도, 가용성 단백질을 생산할 수 있습니다. 그러나, 다운 스트림 응용의 특수 요구 사항 (예 : 동물 실험에서 내 독소가없고 핵산 연구에서 뉴 클레아 제 오염 없음) 또는 단백질의 고유 한 특성 (예 : 디 설파이드 결합 또는 높은 핵산 친화력을 함유하는 쉬운 응집 특성)에는 종종 맞춤형 솔루션이 필요합니다. 이 검토는 이러한 특별한 상황에 대한 응답으로 표현 시스템 선택, 구조 설계 (라벨 및 도메인 경계 최적)에서 정제 프로세스에 이르기까지 정제 된 전략을 제안하고 주요 단계에서 품질 관리 (예 : SEC, SDS-PAGE, 활동 감지 등)를 소개합니다. 일부 응용 분야는 또한 생물 제약 산업의 "품질 보증"(QA) 개념, 즉 체계적인 프로세스를 통한 결함을 방지하기 위해 추가 분석 (예 : 내 독소 검출 및 핵산 잔류 물 결정과 같은 추가 분석이 필요합니다. 품질 관리 가이드 라인을 공식화하고 과학 연구에 사용되는 단백질 시약에 대한 특정 표준을 명확하게함으로써, 목표는 학업 실험실을위한보다 엄격한 단백질 정제 규범을 확립하고 실험 데이터의 신뢰성과 반복성을 향상 시키며 기본 연구와 산업 표준 간의 격차를 해소하는 것입니다.

 

doi : 10.1186\/s 12934-022-01778-5