문학 공유|복잡한 정화에 작별 인사를 하시겠습니까? 새로운 TFF + 계면 활성제 방법은 AAV 벡터 생산의 효율성을 향상시키고 비용을 줄입니다.
유전자 요법은 빠르게 발달하고 있지만 높은 비용은 더 넓은 환자 접근을 방지하는 주요 장벽으로 남아 있습니다. 이 비용의 주요 동인 중에는 Adeno - 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 복잡한 생산 공정이 있습니다. 생명 공학 및 생물 공학에 발표 된 연구는 AAV 정제 과정을 단순화하고 비용을 절감 할 것을 약속하는 접선 흐름 여과 (TFF)를 결합한 새로운 정제 방법을 개발했습니다. 도쿄 대학의 한 팀이 이끄는이 연구를 살펴 보겠습니다.
1. 연구 배경 : AAV 정화의 도전 및 현재 상태
AAV 벡터는 높은 안전성, 낮은 면역 원성, 분열 및 비 - 분할 세포를 감염시키는 능력 및 긴 - 용어 유전자 발현에 대한 용량으로 인해 유전자 요법에서 "별"전달 도구가되었습니다. 그러나, 그들의 생산 공정은 복잡하며, 특히 다운 스트림 정제 단계는 일반적으로 여러 라운드의 원심 분리 및 크로마토 그래피를 포함한다. 이 방법은 시간 - 소비, 노동 - 집약적이고 확장하기 어렵고 비용이 많이 드는 시간입니다.
실험실 규모에서, 정제는 종종 염화 시륨 또는 요오드 산놀 밀도 구배 초 원심 분리에 의존하며, 이는 산업 생산을 위해 확장하기가 어렵다. 친 화성 크로마토 그래피가 점점 더 많이 사용되고 있지만, 필요한 낮은 pH 용리 조건은 바이러스 감염성을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 간단하고 효율적이며 온화하며 확장 가능한 AAV 정제 방법을 개발하는 것이 중요합니다.
접선 흐름 여과 (TFF)는 농축 및 완충에 일반적으로 사용되는 크기 - 기반 분리 기술입니다. 그러나, 종래의 TFF는 AAV 정제 동안 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 DNA와 같은 불순물을 제거하는 능력이 제한되어 있으며, 종종 단백질 응집체를 남겨둔다.
2. 혁신적인 접근 : 효율적인 정제를 위해 계면 활성제와 결합 된 TFF
전통적인 TFF의 한계를 극복하기 위해 연구원 인 Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa 및 도쿄 대학의 동료들은 영리한 전략을 고안했습니다. 계면 활성제를 사용하여 불순물 단백질의 응집 및 상호 작용을 억제하여 TFF Ultrafiltration (500 KDA Moleculars를 통과 할 수 있도록 함). 크기).
그들은 세 가지 유형의 계면 활성제를 테스트했습니다.
- 비 - 이온 :Octyl 글루코 시드
- 음이온 :나트륨 데 옥시 콜레이트
- Zwitterionic :챕터
이 연구는 비 - 이온 계면 활성제 만 사용하는 것이 효과가 없음을 발견했습니다. 음이온 성 나트륨 데 옥시 콜레이트 및 Zwitterionic chaps는 잔류 단백질의 제거를 상당히 향상 시켰으며, 이들은 다른 단백질 집단을 표적으로 하였다. 궁극적으로, 0.5% 나트륨 데 옥시 콜레이트를 1% chaps와 결합하면 놀라운 결과가 생성되어 잔류 숙주 단백질이 거의 완전히 제거되었다. SDS - 페이지 분석은 3 개의 명확한 AAV 캡시드 단백질 대역 (VP1/VP2/VP3) 만 보여주었습니다.
계면 활성제가없는 TFF 정제 과정;(a) SDS - 페이지 겔 전기 영동; (b) 투과 전자 현미경 (TEM)
계면 활성제를 사용한 TFF 정제 과정;(a) SDS - 페이지 겔 전기 영동; (b) 투과 전자 현미경 (TEM)
3. 연구 결과 : 고순도, 활동 및 안전
- 효율적인 불순물 제거 :새로운 방법은 HCP의 99.98% 제거 및 DNA의 95% 제거를 달성했으며, 선호도 크로마토 그래피의 순도는 순도를 초과 하였다.
- 개선 된 감염성 :시험 관내 실험은이 방법을 사용하여 AAV1 벡터가 정제 된 HEK293 세포를 친 화성 크로마토 그래피 (24.9% 대 20.8%)보다 더 효율적으로 감염 시켰으며, 이는 바이러스 생물 활성의 더 나은 보존을 나타낸다는 것을 보여 주었다.
- 생체 내 안전성 :정제 된 AAV1 벡터를 마우스 골격근으로 국소 주사 한 후, 2 주 후에도 유의 한 염증 또는 조직 손상이 관찰되지 않았으며, 이는 생체 내 안전성이 우수한 것으로 나타났습니다.
- 광범위한 혈청 형 적용 가능성 :이 방법은 AAV1, AAV5, AAV8 및 AAV9-From 세포 배양 상청액을 포함하여 다중 혈청 형 -를 성공적으로 정제했습니다. 그러나, 불순물 부하가 높은 세포 용 해물에 주로 존재하는 AAV2의 경우, 추가 최적화가 필요하다.
4. 요약 및 전망
이 연구는 단순하고 빠르고 (1.5 시간) 효율적이며 확장 가능한 새로운 AAV 정제 과정을 개발했습니다. 나트륨 데 옥시 콜레이트와 챕터를 결합함으로써, TFF 정제 동안 잔류 단백질 응집의 도전을 성공적으로 다루었 다.
이 방법의 장점은 다음과 같습니다.
- 가혹한 낮은 pH 조건을 피하고 바이러스 활성을 더 잘 보존합니다
- 크로마토 그래피 단계 감소, 워크 플로를 단순화하며 시간 및 비용 절감
- 쉽게 확장 가능하며 산업 대형 - 스케일 생산에 적합합니다
- 엑소 좀, 기타 바이러스 및 재조합 항체와 같은 다른 생체 크로마 분자 정제를위한 새로운 전략 제공
현재의 한계에는 차선 바이러스 회복이 포함되어 있고 빈 캡시드를 전체 바이러스 입자로부터 분리 할 수 없음이 포함되며, 최상의 사용은 다중 - 단계 정화 워크 플로에서 첫 번째 - 단계 캡처 일 수 있음을 시사합니다.
결론적으로,이 연구는 다운 스트림 AAV 벡터 생산을위한 매력적인 새로운 옵션을 제공하며 유전자 요법 약물의 비용을 크게 줄여서 더 넓은 적용을 촉진 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.
