천연 콜라겐 추출에 한외여과 적용

콜라겐은 천연 단백질 자원으로서 우수한 생체적합성, 낮은 항원성, 생분해성 및 지혈성, 단단한 나선형 구조 및 고유한 특성을 갖고 있어 산업화의 전제 조건을 제공합니다. 콜라겐과 그 부산물은 포장재, 화장품, 헬스케어 제품뿐만 아니라 육류제품의 품질을 향상시키는 식품첨가물로도 사용되며, 특히 의료분야에서 중요한 역할을 합니다.

 

콜라겐이란??

 

콜라겐은 동물 결합 조직의 주요 구성 요소인 생물학적 거대분자이며 포유동물에서 가장 풍부하고 널리 분포된 기능성 단백질로 전체 단백질의 25~30%를 차지하며 일부 유기체에서는 최대 80% 이상을 차지하기도 합니다. 동물세포의 조직을 결합시키는 역할을 합니다.

성인의 신체에는 약 3kg의 콜라겐이 함유되어 있는 것으로 측정되는데, 이는 주로 인간의 피부, 뼈, 눈, 치아, 힘줄, 내장 기관(심장, 위, 내장, 혈관 포함) 및 기타 신체 부위에 존재하며, 기능은 피부와 조직 및 기관의 형태와 구조를 유지하는 것이며, 부상 후 다양한 조직의 회복을 위한 중요한 원료이기도 합니다.

 

콜라겐 단백질의 종류는 다양하며, 일반적인 유형은 I형, II형, III형, V형, XI형입니다. 우수한 생체 적합성, 생분해성 및 생체 활성으로 인해 콜라겐은 식품, 의학, 조직 공학, 화장품 및 기타 분야에서 널리 사용되었습니다.

천연콜라겐 추출방법

가축과 가금류의 동물 조직은 사람들이 천연 콜라겐과 콜라겐 펩타이드를 얻는 주요 방법입니다. 그러나 관련 동물 질병 및 특정 종교적 신념으로 인해 육지 포유류에서 추출한 콜라겐 및 그 제품의 사용이 제한되어 점차 해양 생물로 발전하고 있습니다. 유럽식품안전청(EFSA)은 동물 뼈에서 추출한 콜라겐이라도 광우병 및 기타 관련 질병에 감염될 가능성이 없다는 사실을 확인했습니다. 아미노산 조성과 가교 정도의 차이로 인해 수생동물, 특히 피부, 뼈, 비늘 등 가공 폐기물이 풍부한 콜라겐은 가축 콜라겐에 비해 많은 장점을 가지고 있습니다. 또한 해양 동물에서 추출한 콜라겐은 낮은 항원성 및 저자극성 등 일부 측면에서 육상 동물에서 추출한 콜라겐보다 분명히 우수합니다. 따라서 수생 콜라겐은 점차적으로 육상 동물 콜라겐을 대체할 수 있습니다. 초어 비늘에서 콜라겐을 추출하는 과정을 예로 들었습니다.

 

한외여과법을 이용한 초어 비늘로부터 콜라겐 추출

1. 재료 및 방법

1.1 테스트 샘플

조 콜라겐 수성 추출물.

1.2 테스트 방법

1.2.1 한외여과 공정 경로

 

1.2.2 사전 여과 공정 결정

본 테스트에서는 진공여과 방식과 정밀여과 방식을 비교 분석하여 최적의 사전여과 여과 공정을 결정합니다. 구체적인 테스트 방법은 다음과 같습니다.

① 콜라겐수추출물을 여과지를 진공펌핑하여 여과하여 물추출물 중의 부유입자 및 불순물을 제거하였다.

② 콜라겐 물추출물을 0.2μm 정밀여과막으로 여과하여 물추출물 중의 불용성 물질 및 불순물을 제거하였다.

 

1.2.3 한외여과막 공극 크기 선택

한외여과막의 기공 크기는 100 kDa이었다.

 

1.2.4 한외여과 정제 공정의 단일 인자 실험

한외여과 기술을 사용하여 조 콜라겐 물 추출물을 정제했으며 작동 압력, 작동 온도 및 pH 값이 콜라겐 유지에 미치는 영향에 대한 단일 요소 실험을 연구했습니다. 한외여과 장비를 일정 기간 동안 가동하고 안정화한 후 다양한 요인이 콜라겐 보유에 미치는 영향을 연구했습니다.

 

1.2.5 계산식

 

2. 결과 및 분석

2.1 전처리 과정 분석 결과

진공추출과 정밀여과의 두 가지 여과방법의 비교 결과를 아래 표에 나타내었다.

 

표에서 볼 수 있듯이 진공여과법과 정밀여과법 모두 용액 중의 불순물과 불용성 고형물을 제거할 수 있지만 정밀여과법이 단백질에 대한 보호 효과가 더 우수하여 손실이 명확하지 않으며 진공여과법이 단백질 손실을 일으키기 쉽습니다. 또한, 진공여과 방식은 여과액을 일정 시간 방치한 후에도 혼탁함이 나타나고, 미세여과액은 여전히 ​​맑고 투명하므로 한외여과의 전처리 공정으로 정밀여과를 선택한다.

 

2.2 한외여과 공정의 단일 요소 테스트

2.2.1 한외여과 압력이 보유율에 미치는 영향

온도 40도 및 pH=9.0 조건에서 다양한 한외여과 압력(0.07MPa, {{9})의 영향 }.09MPa, 0.11MPa, 0.13MPa 및 0.15MPa)의 단백질 보유율을 연구했습니다. 결과는 아래 그림에 나와 있습니다.

위 그림에서 볼 수 있듯이, 작동 압력이 증가함에 따라 단백질 보유율은 점차 감소합니다. 작동 압력이 {{0}}.07MPa일 때 단백질 유지율은 96.53%이고, 작동 압력이 0.15MPa일 때 단백질 유지율은 84.38%입니다. 이는 한외여과의 물질 분리 효과가 압력차에 의해 이루어지기 때문이다. 낮은 작동 압력 범위에서는 작은 분자가 막을 빠르게 통과할 수 있는 반면, 큰 분자는 한외여과막에 갇혀 막 표면에 축적될 수 있습니다. 이때, 막 표면과 물추출물은 농도차를 형성하여 농도분극저항이 발생하게 된다. 이때 압력은 상대적으로 낮기 때문에 유지율에 큰 영향을 미칠 수는 없습니다. 그러나 압력이 증가함에 따라 농도 분극 저항은 점차 증가하고 막 표면과 물 추출물 간의 농도 차이는 평형에 도달합니다. 이 평형 이상으로 압력을 가하면 막 표면에 겔층이 형성될 수 있으며(이는 한외여과시 농도분극 및 응축층이 형성된다는 이론과 일맥상통함) 압력이 계속 증가하여 겔층의 두께가 증가하게 된다. , 막 표면에 남아있는 단백질도 증가합니다. 이로 인해 유지율이 낮아집니다. 막의 분리 효과를 보장하기 위한 최적의 작동 압력 매개변수는 0.07MPa입니다.

 

2.2.2 단백질 보유에 대한 온도의 영향

{{0}}.11MPa 압력과 pH=9.0의 조건에서 다양한 온도, 즉 25도, 30도, 35도, 40도 및 45도가 단백질에 미치는 영향 보유를 연구했습니다. 결과는 아래 그림에 나와 있습니다.

위 그림에서 알 수 있듯이, 한외여과막의 유지율은 온도가 증가함에 따라 점차 증가하며, 45도에서 최대에 도달하여 97.01%의 유지율을 나타냅니다. 이는 콜라겐의 점도가 온도와 밀접한 관련이 있기 때문입니다. 온도가 낮으면 콜라겐의 점도가 커지고, 막 표면에 콜라겐이 축적되어 저항이 생기기 쉬워 유지율이 낮아집니다. 온도가 증가하면 콜라겐의 점도가 감소하고 콜라겐 분자 간의 상호작용이 약해지며 물질 전달 속도가 증가하고 농도 분극 현상이 약화되어 유지율이 증가합니다. 유지율이 증가하는 또 다른 이유는 온도가 증가함에 따라 콜라겐의 용해도도 그에 따라 증가하며 콜라겐이 막을 막는 현상이 감소하기 때문에 한외여과의 최적 온도는 45도이다.

 

2.2.3 단백질 보유에 대한 pH 값의 영향

{{0}}.11MPa 압력 및 40 온도 조건에서 다양한 pH 조건, 즉 pH=6.0, pH{{의 영향을 받습니다. 5}}.{{1{12}}}}, pH=8.0, pH=9.0 및 pH=10.0에 대한 유지율을 연구했습니다. 결과는 아래 그림에 나와 있습니다.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>도 7에 나타낸 바와 같이, pH 값이 증가함에 따라 유지율은 점차 증가한다. 이는 한외여과막이 음전하를 띠는 폴리에테르 단풍막인데, 알칼리성 조건에서는 콜라겐이 음전하를 띠기 때문이다. 음전하를 띤 콜라겐 분자는 동일한 전하를 갖는 한외여과막과 상호 배타적인 상태를 형성하므로 콜라겐 분자가 막 표면에 머물면서 막을 차단하기가 쉽지 않습니다. 따라서 한외여과의 최적 pH 값은 8-10입니다.

 

2.3 한외여과 공정 최적화 및 결과 검증

Design-Expert8.05 소프트웨어의 분석에 따르면 최적의 공정 매개변수는 작동 압력 0.14MPa, 작동 온도 40.98 도, 용액 pH{{7 }}.43이며 유지율은 92.551%입니다. 실제 매개변수의 운용성을 고려하여 한외여과 조건은 작동압력 0.14MPa, 작동온도 40도, 원료용액 pH 값 9.50으로 선정하였고, 한외여과 시스템을 가동 및 안정화시킨 후 시험검증을 시작하였다. 유지율 결과는 (92.61±0.1)%(n=3)였습니다. 방정식의 예측값은 기본적으로 측정값과 유사하며, 이는 예측된 조건 매개변수 결과가 실제 조건 결과와 일치함을 보여줍니다.

 

2.4 전기영동 분석 결과

정제된 콜라겐을 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였고, 그 결과를 다음 그림에 나타내었다.

 

위 그림에서 알 수 있듯이, 레인 1은 본 테스트에서 정제된 콜라겐이고, 레인 2는 종아리 힘줄의 표준 콜라겐 시료입니다. SDS-PAGE 전기영동을 통해 본 연구에서 콜라겐을 확인할 수 있으나, a1 펩타이드 사슬과 a2 펩타이드 사슬의 경계가 명확하지 않은 것으로 보인다. 전기영동 지도를 보면 다른 단백질 불순물이 없음을 알 수 있어 정제된 콜라겐이 순도가 높다는 결론을 내릴 수 있다.

가이들링 소개

 

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