박테리오파지의 산업용-하류 정제 — '정화' 및 '한외여과' 섹션

파지라고도 알려진 박테리오파지는 박테리아를 감염시키는 바이러스입니다. 파지는 스스로 생존할 수 없습니다. 번식하려면 숙주 박테리아에 기생해야 하며, 궁극적으로 박테리아가 용해되도록 해야 합니다. 독특한 특성으로 인해 파지는 박테리아 식별 및 유형 지정뿐만 아니라 특정 난치성 박테리아 감염 치료에도 임상적으로 사용될 수 있습니다.

박테리오파지의 구조 모식도이다(이미지 출처: 인터넷).

 

식물 질병은 매년 전 세계 작물 수확량 손실의 30% 이상을 유발하는 것으로 추정됩니다. 다양한 병원체 중에서 세균성 질병은 특히 통제가 어렵습니다. 전통적인 제어 방법은 주로 항생제와 구리- 기반 제제에 의존합니다. 그러나 항생제의 남용으로 인해 항균제 내성이 점점 더 심해지고, 구리 화합물을 장기간 사용하면 환경이 축적되어 인간과 동물의 건강에 위험을 초래합니다.

 

박테리오파지는 특이성이 높기 때문에 유익한 미생물이나 다른 숙주 세포에 해를 끼치지 않고 병원성 박테리아를 선택적으로 죽일 수 있습니다. 따라서 파지는 항생제 및 구리- 기반 제제의 대안으로 사용될 수 있습니다. 파지 치료를 통해 항생제와 구리 화합물의 사용을 줄이면서 병원균을 효과적으로 제거할 수 있습니다.

 

지속적인 과학 및 기술 발전과 박테리오파지에 대한 심층 연구를 통해 슈퍼버그를 치료하기 위해 파지를 사용하는 전망이 점점 더 밝아지고 있습니다. 앞으로 파지 치료는 항생제 내성에 대한 핵심 솔루션 중 하나로 자리잡을 것으로 예상된다. 지속적인 연구와 탐구를 통해 파지 치료법은 항균 치료 분야의 주요 세력으로 부상하여 인간 건강에 더 큰 기여를 할 수 있습니다.

 

그러나 박테리오파지를 안전하고 효과적으로 인체에 투여하려면-특히 정맥(IV) 주사를 통해-한 가지 주요 과제가 남아 있습니다.초순수-파지 제제를 얻는 방법.

파지 용해물은 표적 파지 외에도 숙주 박테리아 및 그 단편, 게놈 DNA 및 숙주 단백질(숙주-관련 불순물)과 같은 주요 불순물을 포함하는 복잡한 혼합물입니다. 지질다당류(LPS)(공정-관련 불순물)와 같은 내독소; 빈 캡시드와 부러진 꼬리를 포함한 제품-관련 불순물.

따라서 정제의 목표는 높은 파지 역가를 달성하는 것뿐만 아니라 불순물-특히 내독소, 숙주 DNA 및 단백질-을 약전 표준에 명시된 극히 낮은 수준으로 줄이는 것입니다.

강력하고 확장 가능한 파지 정제 과정은 일반적으로 다운스트림 처리의 일반적인 원칙을 따르며 다음과 같은 논리적 단계로 나눌 수 있습니다.

박테리오파지의 하류 정제 과정

 

설명 – 거시적 불순물 제거

박테리오파지 정제의 초기 단계에서 정화 단계의 주요 목표는 조 용해물에서 손상되지 않은 박테리아 세포와 큰 세포 잔해를 효율적으로 제거하는 것입니다. 이 단계의 핵심 목적은 다운스트림 크로마토그래피 컬럼 또는 막 분리 장치에 깨끗한 공급물을 제공하여 고체 미립자의 부하를 최소화하는 것입니다. 이는 후속 정제 장치의 막힘을 효과적으로 방지하여 정제 작업 흐름 전반에 걸쳐 안정적인 작동과 높은 프로세스 효율성을 보장합니다.

기존 박테리오파지 다운스트림 공정에서 정화는 일반적으로 0.8μm, 0.45μm 및 0.22μm 필터를 순차적으로 통과하는 다단계 심층 여과-와 결합된-저속 원심분리에 의존하여 숙주 세포 파편과 불순물을 효과적으로 제거합니다.{6}} 성숙하고 신뢰할 수 있지만 이 접근 방식은 여러 단계를 포함하고, 시간이 많이 걸리고, 재료를 반복적으로 전송해야 하므로 전체 수율과 효율성을 최적화할 수 있는 여지가 남아 있습니다.

 

다단계 심층 여과를{0}}미세여과 캡슐프로세스를 크게 단순화하고 강화할 수 있습니다. 구체적으로, 저속 원심분리를 통해 대부분의 세포 잔해물을 제거한 후- 용해물을 직접 처리할 수 있습니다.접선유동여과(TFF)정의된 기공 크기(0.45μm 또는 0.22μm)를 가진 미세여과 캡슐을 사용합니다. 이를 통해 입자상 불순물을 미세하게 제거하고 타겟 파지의 효율적인 침투를 가능하게 합니다.한 걸음, 기존의 세 가지 여과 단계를 하나로 효과적으로 통합합니다.

이 혁신은 작업 시간과 수동 처리를 크게 줄일 뿐만 아니라 여러 여과 단계로 인한 샘플 손실과 오염 위험을 최소화하여 전반적인 파지 회수율을 향상시킵니다. 한편, 접선 흐름 작업은 막 오염을 완화하고 처리량을 향상시키며 공정 견고성을 강화합니다.

 

따라서저속 원심분리와 미세여과 캡슐을 결합한 통합 정화 전략-대규모 박테리오파지 생산의 -효율성과 비용 효율성을-향상시키는 효과적인 접근 방식을 나타냅니다. Guidling Technology의 미세여과 캡슐은 일반적으로 사료 탁도를 아래로 낮출 수 있습니다.20NTU, 후속 한외여과 및 크로마토그래피 단계의 요구 사항을 완전히 충족합니다.

 

포집 및 농축 – 1차 정제 및 부피 감소

동안포획과 농축박테리오파지 정제 단계의 주요 목적은 대량의 정화된 용해물에서 파지를 효율적으로 회수하는 동시에 1차 제품 농도와 완충액 교환을 달성하는 것입니다. 이 단계는 주로 다음 사항에 의존합니다.접선 흐름 여과(TFF)기술.

 

TFF의 원리는 특정 분자량 차단-(일반적으로 100 또는 300kDa)을 갖는 한외여과막을 사용하는 데 있습니다. 잔류 배양액 성분, 대사산물, 작은 단백질 등 작은 분자 불순물은 막 기공을 선택적으로 통과하고, 파지는 잔류물에 남게 됩니다.크기 배제 효과, 효과적인 분리 및 농축이 가능합니다.

TFF 시스템 내에서,한외여과 모드로 전환하면서 볼륨 농도를 달성하기 위해 사용됩니다.정용여과 모드완충액 교환을 허용하여 효소 처리와 같은 후속 단계에 적합한 물리화학적 조건을 생성합니다.

이 기술은 다음과 같은 장점을 결합하여 제공합니다.높은 처리 효율그리고뛰어난 확장성이므로 대규모 생산에-이상적입니다. GuidlingTechnology에 따르면 한외여과 캡슐은 일반적으로파지 회수율 90~95%, 처리되는 특정 재료에 따라 다릅니다.

 

심층 정제 – 중요한 불순물의 표적 제거

박테리오파지 정제에 있어서,깊은 정화최종 제품의 품질을 결정하는 핵심 단계입니다. 그 주요 목표는중요한 불순물의 특정 제거, 내독소와 같은. 전통적인CsCl 밀도 구배 원심분리-독성과 확장성 부족으로 인해-산업 프로세스에서 제거되었습니다. 현재 접근 방식은 다음 사항에 중점을 두고 있습니다.크로마토그래피-기반 기술, 혁신적인 통합으로효소 전처리.

 

결합된 고급 전략음이온 교환 크로마토그래피(AEC)~와 함께알칼리성 인산분해효소(AP) 전처리개발되었습니다. 파지와 지질다당류(LPS)는 모두 음전하를 띠고 있어 기존 AEC 공정에서 결합 부위에 대한 경쟁을 유발하고 동시{1}}용출을 유발하여 정제 효율성을 감소시킵니다. AEC 로딩 전에 AP 전처리를 도입함으로써 효소는 LPS 분자의 지질 A 및 핵심 다당류 영역에서 인산염 그룹을 특이적으로 제거하여 순 음전하를 크게 줄입니다. 이는 음이온 교환 매체에 대한 친화력을 효과적으로 약화시킵니다.

실험 데이터에 따르면 샘플을 다음과 같이 처리하면 됩니다.20U/mL AP다음을 사용하여 정제합니다.4차 아민(Q) 리간드 막 흡착기 또는 모놀리식 컬럼까지 달성할 수 있다98.8% 내독소 제거, 우수한 파지 회수율을 유지하면서. 이 접근 방식은 파지 정제 중 내독소 동시 흡착과 관련된-오랜 문제를 성공적으로 해결했습니다.

연마 – 최종 정제 및 배합

 

결승전에서연마 단계박테리오파지 정제의 주요 목적은 최고의 순도와 제형 준비성을 달성하는 것입니다. 여기에는 미량의 잔류 불순물 제거, 공정 중에 도입된 첨가제(예: 알칼리성 포스파타제) 제거, 제품을 제형-에 적합한 완충 시스템으로 완전히 교환하는 것이 포함됩니다.

이는 일반적으로 다음을 통해 수행됩니다.2차 투석여과, 소분자 오염물질의 철저한 제거와 철저한 버퍼 교환을 모두 가능하게 하는 검증되고 효율적인 방법입니다.

 

제품의 순도를 더욱 높이기 위해,수소-결합 상호작용 크로마토그래피또는혼합{0}}모드 크로마토그래피(MMC)으로 소개될 수 있다최종 폴리싱 단계. 이러한 기술은 다차원 분리 메커니즘을 활용하여 표적 파지와 유사한 물리화학적 특성을 가진 미량 성분을 제거합니다. 그 결과는 다음과 같은 엄격한 품질 표준을 충족하는 고도로 정제된 박테리오파지 활성 제약 성분(API)입니다.주입-등급 제제.

막 면적이 1m²인 정밀여과 및 한외여과 막 모듈의 조합을 선택하면 처리할 수 있는 박테리오파지의 예상 최대 부피는 최대 100L에 이릅니다. 정밀여과 재료 플럭스는 약 20~50LMH이고 한외여과 재료 플럭스는 약 15~30LMH입니다. 기존 처리 방법과 비교할 때 이 접근 방식은 정화 및 한외여과 모두에 대한 공정 요구 사항을 효율적으로 충족할 수 있습니다.

참고자료:

Saavedra et al.,박테리오파지 제제의 확장 가능한 정제 (2025)

Lapraset al.,파지 유효성분의 정제공정 합리화 (2024)