인간 광견병 백신 생산에 한외여과 적용

인간 광견병 백신 생산에 한외여과 적용을 촉진하기 위해 300kDa 한외여과막 카세트를 사용하여 광견병 바이러스 수확 용액을 농축하고 한외여과 후 항원 회수율, 내독소 제거율 및 숙주 단백질 제거율을 검출했습니다. 그 결과, 적정 압력 하에서 광견병 바이러스 수확액은 80배 농축, 25배 용출되었으며, 항원 회수율은 86.2%, 세균 내독소 제거율은 87.5%~88.7%, 숙주 단백질 제거율은 91.6%였다.

 

머리말

 

광견병은 광견병 바이러스(RV)에 의해 발생하는 전통적인 고대 인수공통감염병으로, 치사율이 최대 100%에 이릅니다. 현재로서는 응급백신과 면역글로불린 예방접종 외에 노출 후(즉, 피부 및 점막 손상)에 대한 효과적인 치료법이 없습니다. 인간의 광견병의 주요 원인은 병에 걸렸거나 잠재적으로 감염된 동물(주로 개)에 물린 것입니다. 중국의 광견병 사망률은 세계 2위이며, 광견병은 우리나라 공중보건 안전을 위협하는 문제 중 하나입니다. 광견병 바이러스의 피막 당단백질은 보호 중화항체의 생산을 유도하는 유일한 핵심 항원으로 광견병 바이러스의 새로운 백신과 새로운 진단 및 치료 기술의 연구 개발에 중점을 두고 있습니다.

 

광견병 바이러스는 랍도바이러스과의 광견병 바이러스 속에 속합니다. 뉴클레오캡시드의 모양은 신축성이 있고, 나선형으로 대칭을 이루며, 표면에는 단일 가닥 RNA가 포함된 외피가 있습니다. 광견병을 일으키는 병원체입니다. 광견병 바이러스에는 두 가지 주요 항원이 있습니다. 하나는 바이러스 외막의 당단백질 항원으로 아세틸콜린 수용체와 결합하여 바이러스를 신경 독성으로 만들고 체내에서 중화 항체와 혈구 응집 억제 항체를 생성할 수 있으며 중화 항체는 보호 효과; 다른 하나는 내부 리보단백질 항원으로, 신체가 보체 결합 항체와 침전물을 생성하게 할 수 있으며 보호 효과는 없습니다.

 

내독소는 내열성과 화학적 안정성을 가지며 쉽게 파괴되지 않는 지질다당류 물질(LPS)의 일종입니다. 백신에 일정 농도의 엔도톡신이 있으면 접종 후 심한 발열을 일으키고 심지어 사망까지 초래할 수 있으므로 백신 내 엔도톡신 함량을 최대한 줄여야 합니다. 2005년 중국 약전(제3부)에서는 광견병 백신 내독소 적격 지수의 관리 값이 100EU/용량을 초과해서는 안 된다고 결정했습니다. 막분리 기술의 급속한 발전에 따라 백신의 엔도톡신 함량을 줄이기 위한 한외여과막 분리 기술의 적용이 제약 산업에서 점점 더 널리 보급되고 있습니다.

 

광견병 백신은 광견병에 대한 백신입니다. 광견병 백신에는 일반적으로 정제 베로 세포 백신, 인간 이배체 세포 백신, 1차 세포 배양 백신 등 세 가지 유형이 있습니다. 광견병 백신은 광견병 바이러스 고정 바이러스를 세포 기질에 접종한 후 배양, 수확, 농축, 불활성화, 정제 과정을 거쳐 적절한 안정제를 첨가하여 제조됩니다. 광견병 백신의 주요 기능은 신체를 자극하여 빠른 면역 반응을 일으키고 광견병 바이러스에 대한 보호 항체를 생성하여 바이러스로 인한 감염을 예방하고 질병의 위험을 줄이는 것입니다.

 

 

백신의 생산 과정은 백신의 품질을 보장하는 데 중요한 역할을 하며, 특히 생산 과정에서 일부 지표의 정량화가 더 중요합니다. 인간 광견병 백신 생산 과정에서 한외여과 농축 기술은 인간 광견병 백신을 생산하는 데 필요한 수단입니다. 한외여과 농도에 적합한 개구형 한외여과막을 사용하면 내독소와 숙주 단백질을 효과적으로 제거하고 RV 항원을 유지할 수 있어 백신 생산 및 품질 향상에 도움이 됩니다. RV 분자의 상대적 분자량은 350kDa ~ 460kDa이며, 이론적으로 차단 분자량 100kDa 및 300kDa의 멤브레인 카세트를 사용하여 한외여과 농축을 통해 RV를 완전히 포획할 수 있습니다. 내독소는 응집 정도에 따라 분자 크기가 다르기 때문에 서로 다른 수용액에서 응집 구조를 형성하는 경우가 많습니다. 내독소 단량체의 상대분자량은 10kDa~20kDa이고, 중합형태의 상대분자량은 300kDa~1000kDa 또는 1000kDa 이상이다. 분자량의 차이에 따라 인간 광견병 백신의 RV 항원은 유지되었으며 인간 광견병 백신의 내독소와 숙주 단백질은 300kDa 한외여과막으로 제거되었습니다.

 

본 실험에서는 300kDa 조리개와 0.11m2 막 면적을 갖는 한외여과막 카세트를 소량 시료 처리용으로 사용하여 인간 광견병 백신 중간 생성물을 농축하고 막 플럭스, 처리 효율, 농도 배수, 항원 차단, 엔도톡신 제거 , 숙주 단백질 제거가 테스트되었습니다.

 

2재료 방법

 

2.1 실험재료

광견병 바이러스 고정 바이러스 CTN-IV 균주; 베로세포; 0.5M 수산화나트륨; 300kDa 한외여과막 카세트(PES 재료, 0.11m² 막 면적).

 

2.2 실험방법

2.2.1 바이러스 수확액 준비

냉동된 Vero 세포를 37~39도의 따뜻한 물에서 소생시킨 후, 세포 현탁액을 한 모금 흘린 후, 10% 불활성 송아지 혈청을 함유한 199 배양 배지에 첨가하였다. 균일한 단층 세포를 37도에서 배양했습니다. CTN-IV 균주에 광견병 바이러스를 0.1mol/L 비율로 접종하고 37도에서 배양하였다. 48시간 후 배양액을 버리고 0.1% 인간혈액알부민이 함유된 배양액 199개를 첨가하여 배양온도를 33도 ~ 35도 정도로 유지하였다. 3d-5d마다 한 번씩 질병 독을 수확하고 여러 수확액을 결합합니다.

 

2.2.2 멤브레인 카세트 설치

멤브레인 카세트를 설치하고 아래 그림과 같이 배선을 연결합니다.

 

2.2.3 물 세척

입구 밸브, 리턴 밸브 및 관통 밸브를 닫고 리턴 엔드 및 관통 엔드 파이프를 폐액 탱크에 삽입하십시오. 흡입탱크에 주사용수 1L를 채웁니다.

흡입 밸브와 리턴 밸브를 열고 쓰루 밸브를 닫은 후 펌프를 열고 리턴 라인을 10% 용량의 정제수 또는 주사용수로 세척하고 흡입 압력을 0.35bar(5psi)로 유지합니다.

필터 밸브를 열고 리턴 밸브를 닫은 후 남은 주입수를 사용하여 필터 파이프를 청소하고 TMP를 0.35bar로 유지합니다.

 

2.2.4 소독

흡입 밸브, 리턴 밸브 및 전송 밸브를 닫고 리턴 엔드 및 전송 엔드 라인을 폐액 탱크에 삽입하십시오. 흡기탱크에 세척액 2L를 채웁니다.

흡입 밸브와 리턴 밸브를 열고 스루 밸브를 닫은 다음 펌프를 열고 리턴 라인을 0.5M 수산화나트륨 200mL로 청소하고 흡입 압력을 0.35bar(5psi)로 유지합니다. .

스루 밸브를 열고 리턴 밸브를 닫은 후 TMP를 0.35bar로 유지하면서 200mL의 세척액으로 스루 파이프를 청소합니다.

그런 다음 반환 끝과 통과 끝 파이프가 주기적 청소를 위해 액체 탱크에 삽입됩니다. 공정 접선유량의 1~1.5배로 30분 동안 사이클 세척.

수산화나트륨 0.5M을 배출하고 2.2.4에 따라 중성화될 때까지 주사용수로 헹구십시오.

 

2.2.5 물유속 시험

취수탱크에 정제수를 넣고 취수탱크의 수온을 측정하고 기록합니다. 리턴 엔드를 탱크에 삽입합니다. 펌프를 시동하고 펌프 속도와 복귀 밸브를 조정하여 0.35bar(5psi) 막횡단 압력 차이를 달성합니다. 실린더를 사용하여 통과 끝의 유속을 mL/min 단위로 측정하고 기록합니다. 펌프 속도와 리턴 밸브를 조정하여 1bar(15psi) 막횡단 차압을 얻습니다. 실린더를 사용하여 통과 끝의 유속을 mL/min 단위로 측정하고 기록합니다.

유수량 값을 표준화하려면 계산된 유수량 값을 막간 압력 차이로 나누고 다음 표의 온도 보정 계수를 곱합니다.

 

2.2.6 한외여과 농도

버퍼 상단으로 시스템에서 물을 씻어냅니다. 시스템의 pH 및 이온 안정성을 조정하려면 5분 동안 순환하십시오. 온도를 조정해야 하는 경우 시스템 온도가 안정될 때까지 사이클을 계속하십시오.

흡입 탱크에 공급 액체를 추가하고 공급 유량(예: 400LMH)을 설정한 다음 다양한 TMP 값에서 통과 유량을 테스트합니다. 테스트 데이터에 따르면 TMP를 가로축으로 하고 Flux를 세로축으로 하여 곡선을 그렸습니다.

관통 파이프를 관통 수집 탱크, 폐액 탱크 및 공정 배수구와 같은 적합한 용기 또는 배수구로 연결하십시오.

Feed Tank에 있는 Feed Liquid의 초기 무게를 기록하고 Feed Pump를 가동하여 3~4분간 Feed Liquid를 천천히 순환시켜 줍니다. 재순환은 흐름 경로에 남아 있는 공기를 제거하는 데 도움이 되어 필름 성능을 극대화할 수 있습니다.

스루 밸브를 열고 최적의 접선 유량에 도달할 때까지 펌프 속도를 천천히 높이고 리턴 밸브를 조정하여 시스템의 최적 TMP를 달성합니다.

그런 다음 튜브를 수집 용기에 넣고 액체가 용기에 들어갈 때 타이밍을 시작하고 적절한 간격으로 입구 및 반환 압력을 기록하고 반환 끝과 통과 끝에서 시간이 지남에 따라 액체의 품질을 기록하여 순간을 계산합니다. 유량.

시료의 한외여과 농축은 공급물의 액체 부피가 목표 농도 부피로 감소되면 완료됩니다.

 

2.2.7 투석

흡입관, 보충관, 회수관을 흡입탱크에 넣고 송출관을 수집용기에 넣은 후 수집용기를 저울 위에 올려서 청소합니다.

리턴 밸브를 열고 입구 펌프를 시작한 다음 스루 밸브를 열고 펌프 속도와 TMP를 적절한 값으로 조정합니다. 보충 펌프를 열고 흡입 탱크의 액체 부피를 변경하지 않고 유지한 다음 등량 투석을 시작합니다. 액체가 용기에 들어갈 때 타이밍을 시작하고 적절한 시간 간격으로 입구 끝, 반환 끝의 압력 및 액체의 질량을 기록하고 계산에 의해 순간 유량을 얻습니다.

 

2.2.8 CIP

먼저 완충액으로 헹구고 나서 주사용수로 헹구고(작업 2.2.3), 세척제로 세척한 다음(작업 2.2.4), 마지막으로 주사용수로 헹굽니다(작업 2.2.3).

 

2.2.9 물유속 시험

2.4.5. 작업은 다음과 같습니다.

 

2.2.10 멤브레인 카세트의 보존

단기 보관(3일 이내), 멤브레인 카세트를 고정 장치에 보관하고 보관 용액을 사용하여 10~15분 동안 순환한 후 시스템 밸브를 닫고 액체 펌프에 대한 전원 공급을 차단하고 액체 흡입 탱크가 올바르게 밀봉되었는지 확인하십시오.

보관 기간이 3일~1개월인 경우, 멤브레인 카세트를 고정 장치에서 꺼내어 비닐 봉지나 기타 밀폐 용기에 밀봉해 주세요. 보관용액 50~100mL 정도를 비닐봉지나 밀폐용기에 넣고 밀봉한다. 또는 저장 용액에 직접 담글 수도 있습니다. 다음 표에는 권장 보관 조건이 나와 있습니다.

 

3 결과 및 분석

 

3.1 발열물질 제거효율 영향요인 조사

한외여과 작업 압력: 15개의 테스트 배치를 연속적으로 실행했습니다. 각 배치별로 한외여과시 여과압력을 5, 10, 15, 2{{1{12}}}psi로 유지하였고, 바이러스 수확액을 30배 농축하여 완충액으로 용출하였다. (부피의 10배) 연속 흐름. 아래 표에 나타난 결과, 엔도톡신 제거율은 87.0% 미만, 항원 회수율은 86.0%, 숙주 단백질 제거율은 90.0%로 안정한 것으로 나타났다. 작동 압력의 차이는 항원 회수, 내독소 제거 및 숙주 단백질 제거 효과에 거의 영향을 미치지 않았습니다.

한외여과 농도 비율: 15개의 테스트 배치를 연속적으로 실행했습니다. 각 배치에서 바이러스 수확액은 한외여과 과정에서 각각 3{12}}배, 50배, 80배 및 100배 농축되었습니다. 여과압력은 20psi로 유지하였고, 완충액(부피의 10배)을 연속흐름으로 용출시켰다. 그 결과, 하기 표와 같이 엔도톡신 제거율은 53.3% ~ 86.9% 범위였으며, 항원 회수율은 86.0%로 안정적으로 유지되었으며, 숙주 단백질 제거율은 91.0%로 안정적이었다. 분할 샘플링에서는 전송 용액에서 항원이 검출되지 않았으며, 농축된 바이러스 용액에는 숙주 단백질의 10% 미만이 남아 있었습니다. 바이러스 농축액 내 엔도톡신 농도는 농축배수가 증가함에 따라 증가하였으며, 엔도톡신 제거율은 80배 농축시료에서 가장 높았으며, 제조사에서는 100배 농도도 고려할 수 있었는데, 이는 생산 효율성을 향상시키고 비용을 절감하는 동시에 백신 생산 요구 사항도 충족했습니다.

 

3.2 멤브레인 카세트 플럭스 고갈 및 세척 재생

처리 후 막 플럭스 회수율은 92.6%였다. 새로운 멤브레인 카세트의 첫 번째 회수율은 정상입니다. 공급 액체의 현재 관찰 특성에 따라 두 번째 및 NTH 시간의 후속 예측에 따라 멤브레인 카세트 플럭스 회수율은 이 처리 후 데이터에 가깝습니다. 안정적인 경향이 있습니다. 1회 사용 후 2시간 이내에 멤브레인 카세트가 고갈되는 것이 이상적이었고, 전체 작동 중에 멤브레인 플럭스의 10%만이 고갈되었습니다.

3.2.1 멤브레인 카세트 처리 과정에서 Flux 고갈

3.2.2 멤브레인 카세트 세척 및 재생 결과

 

가이들링 소개

 

Guidling Technology는 바이오 의약품, 세포 배양, 바이오 의약품의 정제 및 농축, 진단 및 산업용 유체에 중점을 둔 국가 첨단 기술 기업입니다. 우리는 원심분리 필터 장치, 한외여과 및 정밀여과 카세트, 바이러스 필터, TFF 시스템, 심층 필터, 중공 섬유 등을 성공적으로 개발했습니다. 이는 바이오 의약품, 세포 배양 등의 응용 시나리오를 완벽하게 충족합니다. 당사의 멤브레인 및 멤브레인 필터는 사전 여과, 미세 여과, 한외 여과 및 나노 여과의 농축, 추출 및 분리에 널리 사용됩니다. 소규모 일회용 실험실 여과부터 생산 여과 시스템, 무균 테스트, 발효, 세포 배양 등에 이르기까지 당사의 다양한 제품 라인은 테스트 및 생산 요구 사항을 충족합니다. Guidling Technology는 귀하와 협력하기를 기대하고 있습니다!