한외여과관 사용시 주의사항

(1) 적절한 한외여과관을 선택합니다. 일반적으로 유지되는 분자량은 목표 단백질의 분자량의 1/3보다 커서는 안됩니다. 예를 들어, 목표 단백질의 분자량이 35kDa인 경우 분자량 10kDa의 한외여과관을 선택할 수 있습니다. 목적 단백질의 분자량이 약 10kd이면 분자량이 3KD인 한외여과관을 사용할 수 있다. 사용 설명서를 주의 깊게 읽고 다양한 화학 물질에 대한 한외여과막의 다른 내성에 주의하십시오.

(2) 새로 구입한 한외여과기는 건조합니다. 사용하기 전에 초순수를 추가하면 물이 멤브레인을 완전히 통과합니다. 얼음 목욕이나 냉장고에서 몇 분 동안 미리 식히십시오. 그런 다음 물을 따르고 단백질 용액을 첨가하십시오. 추가되는 양은 튜브 상단의 흰색 선을 초과해서는 안 됩니다. 조작은 가벼워야 합니다. 단백질 용액을 추가하기 전에 한외여과관을 얼음 위에 삽입하여 사전 냉각해야 합니다.

(3) 균형. 질량과 무게 중심이 균형을 이루어야 합니다. 속도와 가속도가 너무 빨라서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 한외여과막이 직접 손상됩니다. 원심 한외여과를 시작합니다(4도까지 원심분리기 사전 냉각). 다른 원심분리기의 RPM을 G로 변환한 후 다릅니다. 멤브레인에 가해지는 압력을 줄이기 위해 원심분리기의 가속을 가장 낮은 기어로 조정합니다. 참고로 원심분리기에서 나가기 전에 원심분리기가 목표 속도에 도달할 때까지 기다려야 합니다. 그렇지 않으면 원심분리기에 문제가 있는 경우 처음에 처리할 수 없습니다. 멤브레인과 회전축의 방향은 지침에 따라 조정해야 합니다(각도 회전 원심분리기의 경우 멤브레인은 축에 수직입니다). 실제 사용에서 속도는 일반적으로 설명서의 속도보다 낮기 때문에 원심 파이프의 수명을 연장할 수 있습니다.

(4) 남은 1ml로 농축되면 완충용액 50ul를 취하여 10ul를 가하여 파란색으로 변하는지 확인하여 한외여과관에서 단백질이 누출되는지 판단한다. 튜브가 누출되면 상층을 붓고 새 튜브를 통해 흐르고 한외여과를 시작합니다. 튜브 누출 여부를 정확하게 판단하기 위해 5mgml BSA로 10분 동안 원심분리한 후 흐름을 통해 단백질 글루 또는 Bradford를 거친 측정을 위해 실행하고 농축을 위해 나머지 단백질 용액을 계속 추가합니다(단백질이 누출되는 것을 방지하기 위해 얼음 위에서 작동 가열) 모든 농축 용액이 첨가될 때까지. 원심분리 중에 단백질 침전이 발생하여 파이프 막힘이 발생하는지 주의하십시오. 침전이 발생하면 단백질 농도가 너무 높거나 버퍼가 부적절한지 여부를 침전의 특정 원인을 확인합니다. 전자는 농도를 줄이기 위해 여러 한외여과 튜브를 사용한 동시 한외여과로 해결할 수 있습니다. 후자는 단백질이 침전되지 않을 때까지 다른 완충 용액을 변경하는 것입니다.

(5) 이전 단계는 단백질을 농축하는 데 사용됩니다. 완충액을 교환하고자 할 경우에는 총 단백질 용액이 약 1ml로 농축되었을 때 새 완충액(0.22um 한외여과막을 통한 한외여과)을 부드럽게 첨가한 후 약 1ml로 3회 연속으로 농축한다. 최종 농도의 최종 부피는 필요한 단백질 농도에 따라 달라지며 일반적으로 500ul 이하이거나 200ul 미만으로 농축될 수 있습니다. 매번 최소 10배의 부피 농도에 따라 3배 이상 1000배에 도달할 수 있으며 이는 기본적으로 버퍼를 변경하는 목적을 달성할 수 있습니다.